大鼠早期急性胰腺炎外周血及胰腺組織中PTEN表達水平及其意義的研究

張高峰，湯禮軍

急性胰腺炎是消化系統的常見疾病，常見病因有膽源性、高脂源性和酒精性，依據病情輕重可分為急性輕癥胰腺炎、中重度胰腺炎及急性重度胰腺炎。急性輕癥胰腺炎死亡率常較低，急性重癥胰腺炎目前死亡率仍然可達30-50%[1, 2]。對急性胰腺炎病情的早期評估有許多評分系統、影像學資料及生化資料。

PTEN(phosphatase and tensin)是1997 年發現的一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN 作為腫瘤抑制基因，對酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinases，RTK)、磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) 、蛋白激酶B( protein kinase B，PKB又稱Akt)信號通路的調節有關鍵作用。PTEN 在體內可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，引發一系列級聯反應，影響細胞生存、增殖和代謝，從而抑制腫瘤的發生發展[3]。近年來許多的研究證明PTEN與免疫和炎性疾病有關系[4-6]。本實驗就大鼠急性胰腺炎早期，PTEN在外周血水平及在胰腺組織中的表達做一研究。

1 材料與方法

1.1 模型的建立及分組 實驗大鼠選用SPF級的8周齡雄性大鼠36只[簡陽達碩動物科技公司，SC XK(川)2004]，分為A組、B組和C組，每組12只。大鼠術前禁食12h，A組與C組用1.5%戊巴比妥鈉0.25ml/100g(上海國藥集團化學試劑公司)麻醉大鼠后，常規備皮、消毒、鋪巾，做腹部正中切口開腹，找到胰腺后，用一次性靜脈輸液針(山東威高公司)從胰膽管自十二指腸開口處逆行穿刺進入胰膽管，用微量注射泵(浙江浙大醫療設備有限公司)注射4%牛黃膽酸鈉(北京索萊寶科技有限公司)，C組大鼠在關腹前安置一根腹腔引流管，B組開腹后僅翻動胰腺，不做藥物注射。

1.2 標本采集 分別于手術后12小時、24小時兩個時相點對三組大鼠采血并處死大鼠，取其胰腺。采血后以3000RPM離心5分鐘，取上清液，-80℃冰箱凍存。胰腺一部分立即置于液氮中，然后凍存于-80℃冰箱。剩余部分用生理鹽水簡單清洗后固定于10%中性甲醛內。

1.3 指標的檢測 取上述血清，解凍后使用全自動生化儀檢測淀粉酶及脂肪酶；血清中的PTEN蛋白的檢測，采用ELISA法，按照試劑盒說明書(武漢博士德生物工程公司)檢測血清中PTEN蛋白表達水平。對大鼠胰腺中的PTEN蛋白檢測是把標本用10%中性甲醛固定后，進行脫水、石蠟包埋、4um厚度切片；切片制作完成后進行抗原的熱修復，按說明書加入一抗，4℃過夜，標記二抗，DAB顯色后蘇木素復染，中性樹脂封片，光鏡下觀察切片，細胞內出現棕黃色顆粒或團塊為陽性細胞。HE染色是完成4um厚度切片后，依次過二甲苯2次、梯度酒精，蘇木素染色、分化、反藍、伊紅復染、過梯度酒精、二甲苯、中性樹脂封片，光鏡下進行觀察并做病理評分。

2 結 果

2.1 三組大鼠的淀粉酶和脂肪酶的比較 通過單因素方差分析 在造模后12小時和24小時，三組大鼠血清淀粉酶水平差異有統計學意義(F=58.73、45.75，P<0.05)；通過LSD兩兩比較，A組和C組的淀粉酶均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；A組淀粉酶高于C組，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。三組大鼠血清脂肪酶水平差異有統計學意義(F=40.72、46.46，P<0.05)；通過LSD兩兩比較，A組和C組的脂肪酶均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)，A組脂肪酶高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1

表1 三組大鼠淀粉酶和脂肪酶比較

2.2 三組大鼠胰腺病理評分 胰腺的HE染色發現，在A組中，出現了大片胰腺腺泡的壞死、出血和炎癥細胞的浸潤，而在C組中，胰腺表現為壞死程度及炎癥細胞浸潤程度較少一些，B組為并未出現胰腺充血、水腫、壞死(如圖1)。三組大鼠胰腺病理評分差異有統計學意義(F=47.73、28.5，P<0.05)；A組和C組均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)，A組高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠胰腺病理評分

圖1 各組大鼠HE染色(HE×200)

2.3 三組大鼠胰腺組織PTEN檢測結果 用免疫組織化學法檢測PTEN蛋白在各個組之間的表達(圖2)，結果通過圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進行分析，PTEN在三組間的表達差異有統計學意義(F=131、66，P<0.05)；在A、C組中，PTEN的表達(圖中棕黃色顆粒)高于B組，差異有統計學意義P<0.05，A組的表達高于C組，差異有統計學意義P<0.05

圖2 各組大鼠PTEN的表達(免疫組化×400)

組別nFNA組12h625512±3890*#A組24h626894±6013*#B組12h63292±999B組24h63379±703C組12h6 13064±1204*C組24h69693±1972* *與B組比較,P<0.05,#與C組比較,P<0.05

2.4 外周血中PTEN的檢測結果 通過單因素方差分析，在造模后12小時和24小時，三組大鼠血清PTEN水平差異有統計學意義(F=58.73、45.75，P<0.05)；通過LSD兩兩比較，A組和C組的血清PTEN蛋白均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；A組PTEN高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳細結果見表4。

表4 外周血中PTEN檢測結果

3 討 論

急性胰腺炎是消化系統的一種常見的急性炎癥，因為其分型的不同，預后的差別較大，干預和治療的措施也不同，所以早期對病情的預測顯得非常重要。目前對于AP早期的預測，較公認的是一些評分系統，如急性生理和慢性健康狀況評分(acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHE Ⅱ)、Ranson評分、AP嚴重程度床邊指數評分(bedsideindex for severity in acute pancreatitis, BISAP)[7]與CTSI[8]評分等。這些評分系統對AP早期病情的評估有較大幫助，但他們各自的局限性也不能忽略。如Ranson評分需入院后48小時才能完成，可能會錯過干預治療的黃金時機；APACHE Ⅱ評分項目太過復雜，臨床運用是有一定局限性；CTSI評分則依賴于設備，同時某些患者對造影劑過敏也影響其在臨床上的運用。因此，對于AP早期預測的因素也一直未停止探索。

PTEN在腫瘤的相關研究中較多，PTEN可影響細胞的增殖代謝，抑制腫瘤的發生與發展，PTEN在細胞的周期的生命活動中有重要的作用，對目前研究腫瘤的相關治療有重要的意義[9]。近年來，也有許多研究表明PTEN與炎癥有關。在炎癥反應中，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞的趨化需要PI3K的調節，而抑制PI3K就能抑制微生物產物、炎性產物和許多趨化因子對白細胞趨化的誘導，而PTEN可負性調控PI3K，從而在炎癥反應調控中起到重要的作用[9, 10]。在細胞免疫與體液免疫方面，PTEN也與許多調節有關[6, 11, 12]。正是基于PTEN與炎癥之間的關系較為密切，因此本實驗選擇PTEN作為研究對象。

在本實驗中，A組和C組早期的淀粉酶、脂肪酶明顯高于B組,胰腺病理評分也明顯高于對照組，因此對急性胰腺炎造模是成功的；本團隊既往有實驗證實急性胰腺炎早期行腹腔置管引流能明顯改善急性胰腺炎癥的情況；本次實驗中，經早期置管引流后，C組的胰腺病理評分明顯低于B組。

在本實驗中，PTEN表達在A組和C組明顯高于B組,PTEN在急性炎癥早期即有變化，對急性胰腺炎早期的預測可能有一定的幫助。許多文獻都傾向于PTEN是一個炎癥的負性調節因子，但在本實驗中，在胰腺病理評分較高的組別，PTEN的表達相對較高，在胰腺病理評分較低的組別反而表達更低。當然，也有文獻報道，PTEN在巨噬細胞也具有調節作用，但并非簡單的負性調節作用，具有兩面性，不同巨噬細胞刺激因子導致其作用不盡相同，具體機制尚未闡明。目前PTEN是否參與了急性胰腺炎早期的炎癥調節、在哪里環節進行調節，還需進一步的實驗來驗證。

本實驗結果顯示，PTEN可能作為大鼠急性胰腺炎病情嚴重程度早期預測的指標。