煙草主要病害拮抗菌的篩選鑒定及除草活性分析

黃瑞環，芶劍渝，韓小斌，劉 京，彭玉龍，王 丹，張明岳，張成省，趙棟霖*

1. 中國農業科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區科苑經四路11 號 266101

2. 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州省遵義市紅花崗區延安路143 號 563000

3. 青島農業大學，山東省青島市城陽區長城路700 號 266109

煙草赤星病、黑脛病和青枯病是影響煙草產量和品質的重要病害。赤星病為典型流行病，具有間歇性和爆發性的特點［1］；黑脛病可危害烤煙、晾煙、曬煙、香料煙、白肋煙等栽培煙草［2］；而青枯病是典型的土傳細菌性病害，在我國主產煙區普遍發生，造成巨大的經濟損失［3］。同時，煙田雜草與煙株爭肥、爭水、爭光，還是許多病蟲害的媒介和寄主，誘發病蟲害的發生和蔓延［4-5］。目前，煙草病害和煙田雜草的防治主要依賴化學藥劑，導致農藥殘留、環境污染以及病原菌產生抗藥性［6-7］等問題日益突出。生物防治對環境友好，被認為是替代化學藥劑的理想途徑。木霉屬真菌是重要的生防菌，廣泛應用于植物病害的防治中，對煙草病害的防治也有報道。有研究發現，哈茨木霉在培養皿上可吞沒煙草黑脛病菌，對煙草黑脛病菌0號生理小種具有較強的抗性［8］；彭閣等［9］通過平板對峙法篩選出菌株里氏木霉ZP2-1 和擬康寧木霉ZP2-3，對煙草黑脛病菌具有較好的抑制效果；王革等［10］利用誘捕法從土壤中篩選出了1 株木霉菌株（Tv-1）對赤星病菌具有極強的拮抗作用。同時木霉在防除田間除草上也有報道，Javaid A 等［11］用4 種木霉的發酵液對小麥田的兩種雜草進行了除草活性試驗，發現4 種木霉的代謝物可顯著降低兩種目標雜草根和莖生長參數；朱海霞等［12］研究表明，菌株HZ-31 多孢木霉的可濕性粉劑對豬殃殃和藜兩種闊葉雜草的盆栽除草效果顯著高于純發酵液。隨著陸地微生物菌株篩選研究的深入，研究者們把尋找農藥的目光投向了海洋。海洋木霉生長環境獨特，代謝產物結構多樣，且具有特殊的生物活性，是有待開發的新型生防微生物資源。目前海洋木霉在防治稻瘟病、棉花黃萎病、小麥赤霉病上已有研究［13-14］，但海洋來源木霉及其代謝產物用于防治煙草病害和煙田雜草上還鮮見報道。為此，以來源于海南紅樹林的海洋木霉為研究對象，以煙草黑脛病菌、赤星病菌、青枯病菌及煙田雜草反枝莧（Amaranthus retroflexus）為靶標進行了生防菌株的篩選，旨在為進一步開發海洋微生物用于煙草有害生物的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

海洋木霉分離自海南紅樹（根、莖、葉）和紅樹林海泥。

1.1.2 病原菌

供試病原菌為煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、煙草赤星病菌［Alternaria alternate（Fries）Keissler］、煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum），均由中國農業科學院煙草研究所植物保護研究中心提供。

1.1.3 培養基

（1）海洋真菌分離純化培養基：3%海鹽馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基；（2）病原菌培養基：黑脛病菌用燕麥（OA）培養基培養，赤星病菌用PDA 培養基培養，青枯病菌采用營養肉湯（NA）培養基。海洋真菌和病原菌于-80 °C 保藏于中國農業科學院煙草研究所海洋農業研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 海洋木霉的分離

紅樹（根、莖、葉）樣品采用平板稀釋法［15］和組織分離法［16］進行海洋真菌的分離，海泥樣品采用平板稀釋法進行海洋真菌的分離。海洋木霉用3%海鹽PDA 培養基分離，放入28 ℃培養箱中，倒置培養3～7 d，根據菌落顏色、菌絲長短等形態特征挑取木霉菌絲于PDA 培養基中培養，重復2～3次進行純化，并歸類、編號，于-80 ℃超低溫保存。

1.2.2 海洋木霉的鑒定

海洋木霉的DNA 提取方法參考文獻［17］。PCR 擴增采用真菌通用引物ITS1 和ITS4［18］，獲得的PCR 擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定擴增產物的大小。PCR 擴增產物由青島擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，獲得的序列通過Blast 程序在GenBank 上進行比對，選取同源性較高ITS 基因序列進行同源性比較，并采用MEGA7.0 中的Neighbour-joining 法構建系統發育樹，鑒定海洋真菌的種屬。

1.2.3 活性海洋木霉的篩選

將分離的海洋木霉和3 種煙草病原菌（煙草黑脛病菌、赤星病菌和青枯病菌）采用平板對峙培養法［19］進行活性篩選，設置空白對照。每處理3 次重復，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，7 d 后觀察抑制效果。海洋木霉對青枯病菌采用十字交叉法測量其抑菌圈直徑，對黑脛病菌和赤星病菌計算抑制率。計算公式：

抑菌率=［（病原菌對照菌落半徑-病原菌指向海洋真菌的半徑）/病原菌對照菌落半徑］×100%

（1）

1.2.4 除草活性

將反枝莧種植于邊長10 cm 的正方形塑料盒中，每盒20 粒，在人工氣候箱中（28 °C，12 h 光照，12 h 黑暗）培養1 周。海洋真菌采用PDW 培養基振蕩培養9 d 后，其發酵液用乙酸乙酯萃取兩次，用旋轉蒸發儀在40 ℃和90 r/min 的條件下濃縮蒸干。海洋真菌發酵提取物用4%甲醇-無菌水溶解，并加入0.2%農乳1602（三苯乙烯基苯酚聚氧丙烯聚氧乙烯醚）助溶，配制成10.0 mg/mL 的溶液，噴霧于葉片和莖上，每盆噴霧量3 mL。以等量無菌水溶液和草甘膦為對照，置于28 ℃人工氣候箱中，12 h 光照，12 h 黑暗，7 d 后觀察除草效果。

1.3 數據處理

采用Excel 2019 和MEGA7.0 軟件進行數據處理、分析和作圖。用SPSS Statistics 19 軟件、Duncan’s 新復極差法檢驗數據差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 海洋木霉分離鑒定及多樣性分析

從海南紅樹根、莖、葉和海泥樣品中共分離得到25 株海洋木霉。其中從紅樹根中分離得到11株，占總數的44%；海泥中分離得到10 株，占總數的40%；莖中得到4 株，占總數的16%；紅樹的葉中沒有分離得到木霉，見圖1。

通過分子生物學鑒定，將PCR 產物進行測序，并將所測序列在美國生物信息中心（NCBI）數據庫中用Blast 進行相似性搜索，發現所得木霉和與其序列最為接近的木霉相似度均在99%～100%之間，由此確定菌株種屬范疇。將測序后獲得的ITS序列提交到GenBank 數據庫中，獲取其登錄號。

圖1 不同樣品分離的木霉數量比較Fig.1 Amounts of Trichoderma sp. isolated from different samples

根據這25 株木霉的ITS-rDNA 序列及Blast 比對結果，利用MEGA 7.0 軟件，分析堿基組成并用鄰接法構建系統進化樹，見圖2。從圖2 可以看出，25 株海洋木霉屬于5 個種。HJ5、HJ7 等17 株木霉為棘孢木霉（Trichoderma asperellum），HT8 和HT10 為鉤狀木霉（Trichoderma hamatum），HT11 為擬康寧木霉（Trichoderma koningiopsis），HT6、HT7為 里 氏 木 霉（Trichoderma reesei），HT4、HT12 和1HT 為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。25 株海洋木霉中，棘孢木霉占68%，哈茨木霉占12%，鉤狀木霉和里氏木霉分別占8%，擬康寧木霉占4%。

2.2 海洋木霉對煙草病害的拮抗效果

通過平板對峙培養，測定了25 株木霉對煙草黑脛病菌、赤星病菌和青枯病菌的抑制作用，對黑脛病菌和赤星病菌的抑制率分別達60%和40%。多數海洋木霉對煙草黑脛病菌和赤星病菌具有明顯的拮抗作用（表1），只有HT6 和HT7 兩株木霉對青枯病菌有抑制作用（圖3）。從表1 中可以看出，23 株海洋木霉對煙草黑脛病菌的抑制率達到30%以上，HT2、HT6、HT8、HT11、HJ3、5HJ、HJ7、HG2、HG9、9HG、HG11、HG14 和HG16 共13 株海洋木霉的抑制率達到60%以上，其中以5HJ 的抑制效果最好，抑制率為84.1%。HT11、HG11、HT3、HG16 和HG9 等5 株木霉對煙草赤星病菌的抑制效果較好，分別達到40.3%、42.9%、43.7%、44.5%和47.9%。5HJ、G9、HG16 和HT11 等對煙草黑脛病菌和赤星病菌均具有較好的抑菌效果。

2.3 海洋木霉對反枝莧的抑制效果

從圖4 和表2 中可以看出，多數海洋木霉提取物對雜草反枝莧的除草效果不明顯，僅有HT10 和1HT 兩株木霉的提取物對反枝莧的生長有抑制作用。HT10 的除草活性較高，經其發酵提取物處理后的反枝莧葉片出現枯萎、生長不正常、葉片發黃；1HT 處理的反枝莧部分葉片呈現紅色斑點，部分嫩葉出現枯萎，葉片發黃。由于HT10 除草效果更為明顯，因此可考慮從HT10 發酵提取物中尋找具有除草活性的先導化合物。

圖2 海洋木霉與參考分類群間的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree between marine-derived Trichoderma sp. and reference taxa

表1 木霉對煙草黑脛病菌和赤星病菌的抑制率①Tab.1 Inhibition rates of Trichoderma sp. against Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker and Alternaria alternata（Fries）Keissler （%）

圖3 5HJ、HG9、HT6 和HT7 平板對峙抑菌效果Fig.3 Antibacterial effects of 5HJ, HG9, HT6 and HT7 plates

圖4 HT10 和1HT 對反枝莧的除草效果Fig.4 Herbicidal effects of HT10 and 1HT against A. retroflexus L.

表2 木霉對反枝莧的抑制效果①Tab.2 Inhibition effects of Trichoderma sp. against Amaranthus retroflexus L.

3 結論

從海南紅樹和海泥中分離得到25 株海洋真菌，鑒定為5 種木霉。其中棘孢木霉（T. asperellum）為優勢種。海洋木霉及其提取物對煙草黑脛病菌（P. parasitica var. nicotianae）、赤星病菌［A. alternate（Fries）Keissler］和青枯病菌（R. solanacearum）3種病原菌均有抑制效果。其中，3 株棘孢木霉5HJ、HG9、HG16 和1 株擬康寧木霉HT1 對煙草黑脛病菌和赤星病菌有較好的抑制效果；1 株鉤狀木霉HT10 和1 株哈茨木霉1HT 具有潛在除草活性?？梢姡Ｑ竽久苟鄠€屬種表現出了抗菌除草活性，具有開發成為新型生物農藥的潛力。