三七絨根栽培白參菌及皂苷轉化初步研究

張玉潔，王禎元，韋繼雯，陳中堅，閆倩玲

（1.文山學院 三七研究院，云南 文山 663099；2.文山學院 環境與資源學院，云南 文山 663099；3.文山州食品藥品檢驗研究院，云南 文山 663099）

白參菌（Schizophyllum commune Fr.）別名樹花、裂褶菌、白花、八擔柴、雞毛菌子、雞冠菌等，為傘菌目（Agaricales）裂褶菌科（Schizophyllaceae）裂褶菌屬（Schizophyllum）[1]。白參菌子實體秀雅、味道馨香爽口，其作為一種食藥兼用菌類，包含5種常量元素和26種微量元素，具有富硒作用[2]。研究顯示其細胞壁多糖具有免疫調節和抗炎、抗癌作用[3]。白參菌作為一種木腐菌，較易在腐爛的木頭或者草本植株上生長，要求較為濕潤和偏弱酸性的生長環境[4]。葡萄糖是白參菌菌絲生長的最適碳源，最適的氮源是蛋白胨，最適碳氮比值為40∶1，在碳氮比不同的培養料中栽培，白參菌菌絲生長速度不同，或生長遲緩或生長受到抑制[4]。野生白參菌的采摘會受季節限制，而且產量較少。至今為止，白參菌人工栽培生物學轉化率和產量仍然較低[5]，目前仍屬于稀有菌類和食藥兼用菌類。

三七是云南大宗產業、文山是三七之鄉。三七采挖抖落的土壤中含有大量的絨根，其中也含有一定量的三七皂苷。研究利用三七絨根栽培食用菌既可以清理土壤殘留，又可以有效利用中藥材的邊角廢料，生產功能食品。

1 材料和方法

1.1 原材料和試劑

三七絨根篩自三七采挖抖落的土壤并曬干保存。白參菌菌種由實驗室分離得到，保存于文山學院三七研究院。麩皮、小麥、石膏粉、木屑、馬鈴薯、甘蔗渣等從文山市場購買；耐高溫栽培袋、蓋、塞等由專業訂購。三七總皂苷、薄層層析板和分析試劑購自深圳市商祺檢測器材有限公司。

1.2 母種擴繁和栽培種制作

利用PDA培養基活化并擴繁母種。利用小麥粒培養基擴繁栽培種[6]。

1.3 配料、裝袋、滅菌、栽培、養菌、出菇管理和子實體采集

參考前期研究[7]，采用以甘蔗渣為主料的配方為對照栽培白參菌，以不同比例的三七絨根替代其中的甘蔗渣為實驗組。實驗組和對照組原料及配方如表1。

表1 培養料及配方/%

各實驗組和對照組按照培養料配方和所需原料的總量來備料。三七絨根和甘蔗渣剪碎稱重后分別浸泡。將含水量調至60%后備用。

利用17×46×0.15 cm聚丙烯耐高溫菌袋。每個菌包裝料500 g（濕料），包括4個實驗組和1個對照組。每組20個菌包，共100個。

滅菌：121 ℃，2.5 h。

接種：接種需要在無菌環境下進行。用種量為5%。

菌絲培養：白參菌屬于中低溫型菌類，菌絲生長要求15～26 ℃間，出菇溫度控制在16～23 ℃。適宜溫度下在接種后20 d左右開始出菇。其最佳種植季節是春栽3～5月，秋栽9～11月，在大棚種植環境下可以完成每年4～6茬，同時還可以完成工廠化控溫周年化的生產。

出菇管理和子實體采收參考[7]：開袋出菇，噴水保濕并保持通風良好。待子實體葉片長到將要平展時進行采收。每組采收2潮。

產量統計分析：記錄并統計各實驗組和對照組白參菌菌絲生長速度（菌絲長滿菌袋所需時間）和子實體的平均產量。采用SPSS17.0軟件和Microsoft Excel 2003對各組數據進行統計分析。

1.4 子實體中皂苷類成分的跟蹤檢測

真菌細胞可以選擇吸收環境中的小分子物質，進入細胞的小分子有機物有些可以被細胞里的酶進行基團轉化或修飾。因此，利用薄層層析方法檢測三七皂苷被白參菌菌絲吸收及轉化情況。

所檢樣品分為兩組。一組是子實體組，包括未添加三七絨根所培養采收的白參菌子實體和分別添加10%，15%，20%三七毛根所培養的白參菌子實體；另一組為菌糠組，分別為添加了10%，15%，20%三七絨根培養白參菌采收子實體后所剩余的菌糠。

樣品處理：將各樣品進行干燥、研磨，粉碎備用。

皂苷提取：每樣品稱量5 g，加水50 mL，超聲震蕩30 min，離心去殘渣。取濾液揮干至10 mL左右，用D-101大孔樹脂凈化柱過濾（小柱用10 mL水沖洗），棄去水液。用70%甲醇（42.7蒸餾水+57.2甲醇）25 mL洗脫皂苷，收集甲醇溶液，水浴揮至近干，殘渣以甲醇溶解定容至5 mL，進行層析檢測。

對照：三七總皂苷標準品（含量以三七皂苷R16.9%,人參皂苷Rg128.0%,人參皂苷Rb129.7%,人參皂苷Rd 7.3%）,加甲醇制成1 mL各含5 mg的混合溶液。另取三七粉0.5 g，與供試樣品一起處理，抽提皂苷成分作為陽性對照。

利用高效硅膠60預制板（Merck）為層析板，以氯仿∶甲醇∶水（65∶35∶10）為展開劑，供試液與對照液分別點樣0.2 μL。展開箱預平衡15 min，上行展開，展距7 cm。噴以硫酸乙醇液（1∶10）染色。

2 結果與分析

2.1 三七絨根栽培白參菌的生物學表現

利用甘蔗渣和少量的三七殘根為主料栽培白參菌，菌絲初期生長很快，中后期由于內部供氧不足而生長緩慢，限制了菌絲生長速度，刺孔增氧后菌絲逐步延伸到袋底。統計顯示，少量的三七殘根不會抑制白參菌菌絲生長，反而會有一定的促進作用并可增加子實體產量。15%以上的三七絨根開始顯著抑制菌絲生長，并可降低子實體產量。當三七絨根用量超過20%時，菌包內菌絲生長稀疏、只生長出很少的子實體，表明白參菌細胞對三七殘根的耐受能力具有一定的限度。表2和表3分別顯示各組菌包菌絲長滿菌袋所需的平均時間，菌絲平均日生長速度、袋均產量和生物轉化率。

圖1 普通培養基栽培的白參菌

圖2 三七絨根培養基栽培的白參

表2 不同含量的三七殘根對裂褶菌菌絲生長速度的影響

表3 不同配方培養料對裂褶菌產量和生物學效率的影響

2.2 皂苷成分的跟蹤檢測

將從各級樣品中抽提的皂苷類生物堿，利用薄層色譜法進行展層和染色得到如下皂苷色譜圖。

左側層析板由左到右分別為三七總皂苷、菌糠（含絨根10%）、菌糠（含絨根15%）、菌糠（含絨根20%）；右側層析板從左到右為白參菌子實體（10%殘根料培養所得）、三七粉、 三七總皂苷、子實體（15%殘根培養所得）、子實體（20%殘根培養所得）。三七總皂苷（三七皂苷R16.9%,人參皂苷Rg128.0%,人參皂苷Rb129.7%,人參皂苷Rd 7.3%）

總皂苷標準品自下而上分別為人參皂苷Rb1，Re，三七皂苷R1，人參皂苷Rd。

其中，利用三七粉抽提所得三七皂苷和皂苷標準品主條帶基本一致。左側層析板顯示，各實驗組菌糠中皂苷成分與標準品相比都有所變化，表現為下面兩個條帶的減少和展層上面條帶的增加。此效果或許因為培養料中三七皂苷在高溫高壓過程使Rb1，Re分子中的糖配體被降解，或許因為菌絲生長過程中白參菌細胞對皂苷分子進行了生物轉化轉化。

圖3 菌糠與子實體中皂苷含量層析色譜

對子實體中皂苷類物質成分檢測的結果顯示，有些小分子皂苷被白參菌菌絲成功吸收。說明三七皂苷成分可以被菌絲吸收并被轉移到白參菌子實體中。

3 結論與討論

利用三七殘根培養白參菌，子實體中會出現與三七粉和三七皂苷標準對照品中某些對應的三七皂苷植物堿的染色點，說明白參菌菌絲體吸收了培養料中的某些小分子皂苷成分或皂苷的降解產物。

培養料中添加少量的三七根對白參菌菌絲生長具有促進作用，并可提子實體高產量。三七根的用量超過15%會抑制白參菌菌絲體和子實體的生長，說明白參菌對三七絨根的利用有機一定限度。