不同干燥條件的三七中三七素含量的測定

宋建平，婁 潔，張志信，梁 教

（文山學院 化學與工程學院，云南 文山 663099）

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)珍貴中藥材，為云南省文山州道地藥材。三七飲片具有“散瘀止血，消腫定痛、益氣活血的功效。用于跌撲腫痛、內(nèi)外出血、氣虛血瘀、脈絡(luò)瘀阻、胸痹心痛、中風偏癱，氣虛體弱；軟組織挫傷、出血性疾病、高血壓、冠心病、腦卒中、高脂血癥、糖尿病血管病變、免疫功能低下見上述證候者”[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為三七有生、熟用藥之分及“生打熟補”，生三七用于止血祛瘀、消腫止痛，熟三七主要用于補血、補氣。有學者研究認為，三七的生熟之分主要是炮制過程中三七中的各種化學成分含量、結(jié)構(gòu)、比例均發(fā)生改變而引起[2]。三七素是三七中存在的一種特殊的水溶性氨基酸，其化學名為β-草酰-L-α，β-二氨基丙酸，1981年日本學者首次從三七中發(fā)現(xiàn)將其命名為三七素。藥理研究證明，三七素能明顯縮短凝血時間、凝血酶原時間和凝血酶時間，提高血小板數(shù)和黏附率，增強血小板的功能，起到止血的作用[3]。三七的干燥方法傳統(tǒng)上采用自然晾曬，近年來隨著產(chǎn)量增加采用快速烤房干燥的三七量已占絕大多數(shù)。對三七中皂苷在不同干燥條件下的變化研究較多，但對三七素的影響尚未見報道。基于三七素有一定的神經(jīng)毒性，在干燥階段是否對其含量有影響，對三七飲片的深度開發(fā)有指導(dǎo)意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

鮮三七：購買于云南省文山州三七國際交易市場；冷凍干燥三七（文山華信三七股份有限公司、云南省文山市華信三七加工廠加工處理；生產(chǎn)批號：1601001；生產(chǎn)日期：2016/01/06）；三七素標準品（合肥博美生物科技有限責任公司，純度＞98%、BZP1872）；甲醇（色譜級，Sigma公司）；超純水（娃哈哈礦泉水）。

本實驗所用鮮三七均來源于云南省文山州，采收期為2017年12月。經(jīng)過不同的干燥方式干燥處理而成（冷凍干燥三七除外，下同），樣品信息見表1。

表1 樣品采集信息

1.2 儀器

Thermo SCINTIFIC U3000型高效液相色譜儀（德國賽默飛公司）；101型電熱鼓風干燥箱（四川中智旗云通用設(shè)備有限公司）；高速萬能粉碎機FW135型（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；ISO-9001型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；80-2型低速臺式離心機（金壇市大地自動化儀器廠）；SK-18TC超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；W201D數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；津騰尼龍66（Nylon）0.22um微孔濾膜；醫(yī)用注射器；移液槍（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

2 方法與過程

2.1 液相條件

Thermo SCINTIFIC U3000型高效液相色譜儀，SyncronisC18（150 mm×4.6 mm，5 um）色譜柱；流動相為：甲醇—（0.1%磷酸）∶水（85∶15）；等度洗脫15 min；體積流量1 mL/min；進樣量2 μL；柱溫25 ℃；檢測波長213 nm。

2.2 三七素含量測定方法

2.2.1 標準溶液的制備

精密稱取三七素標準品（相對分子質(zhì)量為176.13）0.0050 g于150 mL燒杯中，加入一定量超純水，超聲處理使其完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL的標準品儲備液。

2.2.2 標準曲線的繪制

設(shè)置序列進樣量為 1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 uL、10 μL的標準品溶液（對應(yīng)濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/μL），依次進樣按照 2.1的色譜條件測定三七素的峰面積值。以峰面積值（y）對樣品量（x）進行線性回歸，如圖1，得線性回歸方程為：y=21.257x+0.2325,得到R2=0.9999。由圖1可知：三七素的樣品量在0～2.0 μg范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 三七素標準曲線

2.2.3 樣品的處理

將新鮮三七清洗，去除須根，再切片。按表2的干燥方式進行處理，再將不同干燥方式下得到的三七放入高速萬能粉碎機粉碎，得到三七干燥粉末。

稱取不同干燥方式的三七粉末1.0000 g（詳細稱取信息見表2），放于具塞錐形瓶中，料液比為1∶10（g∶mL），加入蒸餾水10 mL，在功率為750 W，頻率為25 kHz,水浴溫度為25 ℃的超聲清洗器中超聲15 min連續(xù)提取2次，將濾液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，合并兩次上清液于40 ℃的恒溫水浴鍋濃縮20 min，再將其轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度線，得到該系列的三七素提取液。

首先，取適量該系列三七提取液于定性濾紙上，再加入2滴4%茚三酮溶液，進行顯色反應(yīng)[4]；其次，用注射器取適量的三七素提取液過0.22 μm微孔濾膜，裝入進樣瓶中，并做好標記；最后，將處理好的樣品置于進樣盤上進行含量測定。

表2 樣品的稱取質(zhì)量

2.2.4 茚三酮顯色劑的配制

精確稱取苯并戊三酮2.0000 g，用蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中并定容至刻度線。

2.2.5 內(nèi)標法的制作

用移液槍移取等量的三七素標準溶液與樣品液1于同一裝樣瓶中，超聲3 min后按照2.1中液相條件進行三七素含量的測定。

3 實驗結(jié)果與結(jié)論

3.1 標準品的HPLC圖

標準溶液的HPLC如圖2所示

圖2 標準溶液的HPLC圖

3.2 三七素的保留時間

實驗得到樣品與三七素標準品的保留時間對比圖，如圖3所示，最上為標準品，1～8號依次從上往下，進行對比可知，保留時間都在1.5 min。

圖3 1～8號樣品與標準品中三七素的HPLC圖

3.3 內(nèi)標實驗的結(jié)果

將1號樣品、標準品、加內(nèi)標的1號樣品HPLC的峰面積進行對比，如圖4所示，1.5 min處的峰由上到下依次為：1號樣品、加內(nèi)標的1號樣、標準品的三七素峰。

圖4 1號樣品、標準品、加內(nèi)標的1號樣品的HPLC圖

3.4 三七素含量測定的實驗結(jié)果

由測得的三七素峰面積按照線性回歸方程為：y=21.257x+0.2325進行計算，結(jié)果如表3所示。

表3 三七素的含量

4 結(jié)論

本實驗采用低溫超聲提取，離心分離得到三七素粗提液，克服了分離難的問題，又避免了三七素受到高溫作用而可能發(fā)生的變性問題。用HPLC法測定不同干燥條件的樣品粗提液中三七素的含量。

實驗結(jié)果表明，在相同的提取方法下，不同的干燥溫度并未發(fā)現(xiàn)三七素的含量呈線性變化，40 ℃烘干和日光自然曬干條件下三七的含量最低，而在烘箱干燥50 ℃條件下三七素的含量最高。可能與溫度較低時干燥的時間需要更長，三七中的酶對三七素有一定的分解作用有關(guān)。

本實驗中，因為提取的樣品沒有經(jīng)過分離純化，在三七素粗提液中含有較多的雜質(zhì)，所以粗提液要放置3 d之后再進行測定。此時粗提液中的其它雜質(zhì)物質(zhì)會沉降下來，在經(jīng)過微孔濾膜的過濾可以使原本溶于水而沉降出來的雜質(zhì)與三七素分離。實驗所用的液相條件對三七素的色譜峰與其余雜峰達到很好的分離效果。