日本結縷草ZjNAC2基因的克隆、亞細胞定位及表達分析

姜紅巖，張 蕊，滕 珂，檀鵬輝，劉凌云，尹淑霞

（1.北京林業大學草坪研究所，北京 100083；2.北京草業與環境研究發展中心，北京 100097）

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子，在調控植物生長發育、葉片衰老、響應生物和非生物脅迫等方面發揮著重要作用[1-3]。大量研究表明，NAC轉錄因子在轉基因育種中具有很重要的作用和應用價值[4]。過量表達NAC基因的植株對非生物脅迫具有一定的抗性，因此可以通過轉基因技術獲得更多的抗干旱、抗鹽堿等新的轉基因材料[4-5]。全基因組分析已在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、葡萄(Vitis vinifera)、楊樹(Populus tricocarpa)和大豆(Glycine max)中分別鑒定出117、151、79、163、152個 NAC[6-7]。在紫花苜蓿 (Medicago sativa)[7]中MsNAC1基因可能參與了非生物逆境脅迫的生理響應，在高鹽、干旱和低溫處理下表達量均表現為先上升后下降的趨勢。番茄(Lycopersicum esculentum)[8]SlNAC1的過表達提高了番茄植株的耐冷性，同時高溫、鹽、干旱等非生物脅迫和多種激素均會誘導SlNAC1基因的表達。在水稻[9]中OsNAC5、OsNAC6、OsNAC9和OsNAC10的過表達株系通過根結構適應和調控參與應激反應、防御反應和ABA生物合成的基因來增強耐旱性。Le等[10]研究表明，低溫、機械損傷及防御相關的激素(水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸和乙烯)均會誘導葡萄葉中VvNAC1的表達。

結縷草(Zoysia japonica)是我國重要的暖季型草坪草，分布廣泛，普遍應用于各地的運動場、園林綠化等各種草坪[11]。但由于我國結縷草種質資源研究起步晚，其育種工作遠遠落后于發達國家[12-14]。現代生物技術發展加快了新品種的選育，為進一步改良草坪草的遺傳性狀提供了條件，加快了草坪草遺傳改良的步伐[13,15]。目前對結縷草的研究多數以其抗性為主，利用生物技術通過對其抗性基因抗性機理的深入研究，可為結縷草新品種的培育提供理論依據。本研究通過克隆日本結縷草的ZjNAC2轉錄因子及其啟動子，分別對其進行生物信息學分析，研究ZjNAC2基因在不同組織和不同的發育時期及干旱、高鹽和激素處理下葉片中的表達情況；同時研究ZjNAC2基因的亞細胞定位，旨在為進一步深入探究ZjNAC2基因在日本結縷草中的分子調控機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用日本結縷草為‘Meyer'，由江蘇省中科院植物研究所惠贈；RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒均從OMEGA公司購買；反轉錄試劑盒、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、pMD19-T載體、SYBR Mix購自TaKaRa公司；大腸桿菌感受態DH5α均從北京全式金生物技術有限公司購買；2 × GoldStar MasterMix從康為世紀公司購買；Seamless Assembly Cloning Kit從中美泰和生物公司購買；乙烯利(ET)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲脂(MeJA)和PEG4000從SIGMA公司購買。農桿菌菌株EHA105、亞細胞定位載體3302Y3及本生煙草(Nicotiana tabacum)均由北京林業大學草坪研究所實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1ZjNAC2基因及其啟動子克隆

首先以健康生長3個月的日本結縷草植株為材料，根據RNA提取試劑盒中的說明書提取總RNA，以CTAB法提取DNA。提取的總RNA經NanoDrop 2000(Thermal Fisher,USA)和1%的凝膠電泳檢測合格后，以其為模板，利用反轉錄試劑盒獲取日本結縷草的cDNA。以獲得的cDNA為模板，利用RACE技術進行3'/5'RACE擴增。產物純化后與pMD19-T載體連接，然后轉化大腸桿菌感受態DH5α，陽性克隆菌液送公司測序。從測序正確的菌液中提取質粒，用于后續試驗。

以提取的DNA為模板，根據設計的特異性引物SP1、SP2、SP3(表1)進行染色體步移，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后將條帶單一的PCR產物送入公司測序。經序列比對正確后，設計啟動子特異性引物ZjNAC2-Pro-F/R(表1)，用于擴增啟動子序列。反應程序為 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃100 s，40個循環；72 ℃ 5 min。產物純化后與pMD19-T載體連接，然后轉化大腸桿菌感受態DH5α，陽性克隆菌液送北京睿博興科生物技術有限公司測序。從測序正確的菌液中提取質粒，用于后續試驗。

1.2.2 生物信息學分析

利用DNAMAN 8.0軟件預測ZjNAC2編碼的蛋白序列；通過NCBI數據庫Blast功能篩選ZjNAC2基因的同源蛋白序列，然后利用MEGA 5.0軟件采用Neighbor-jointing法構建系統進化樹；通過SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的分子量、等電點及親疏水性等；分別通過(http://www.softberry.com/) 和 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)預 測ZjNAC2的亞細胞定位情況和ZjNAC2基因啟動子可能存在的作用元件。

1.2.3 亞細胞定位

以測序正確的PMD-ZjNAC2質粒為模板，以設計的3302Y3-ZjNAC2-F/R為構建載體的引物(表1)，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行PCR擴增，反應程序 98 ℃ 10 s；98 ℃ 10 s，68 ℃ 40 s，25 個循環；72 ℃ 3 min。同時用BglⅡ單酶切3302Y3載體。通過Seamless Assembly Cloning Kit將純化后PCR產物與酶切產物進行連接。將連接產物轉化涂板后，挑取陽性克隆進行檢測。將構建成功的3302Y3-ZjNAC2及空載3302Y3轉化農桿菌EHA105，參照Yang等[16]的方法用注射器將重懸后的菌液注射本生煙草(Nicotiana tabacum)，暗培養48 h，之后通過激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光蛋白的分布情況。

1.2.4 基因表達分析

分別剪取根、莖、葉，以及不同衰老程度的葉片，液氮速凍后提取總RNA。對長勢一致的‘Meyer'日本結縷草分別噴施 10 μmol·L-1脫落酸 (abscisic acid,ABA)、10 μmol·L-1茉莉酸甲酯 (Methyl Jasmonate，MeJA)、200 μmol·L-1乙烯(ethylene,ET)、300 mmol·L-1NaCl、20%PEG4000，分別在0、1、3、6、12 和24 h取樣，液氮速凍后-80 ℃保存，之后提取總RNA。以設計qPCR-F/qPCR-R(表1)為熒光定量引物，以日本結縷草Actin基因(GenBank登錄號：GU290546)為內參，參照SYBR Mix說明書進行qRT-PCR反應。本研究采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 引物列表Table 1 Primer list

2 結果與分析

2.1 基因克隆與生物信息學分析

通過RACE技術獲得了ZjNAC2目的基因(圖1)，該基因的開放閱讀框為1 110 bp，編碼369個氨基酸(GenBank登錄號：MH580281)。用ExPASy server預測ZjNAC2的理論等電點為8.32，平均分子質量為39 847.05；酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)和堿性氨基酸酸殘基總數(Arg+Lys)分別為32個、35個；親水性平均值預測為-0.360，以上預測表明ZjNAC2屬于親水性蛋白。信號肽預測表明，ZjNAC2基因中不含有信號肽。亞細胞定位預測結果顯示，ZjNAC2定位于細胞核。系統進化樹分析結果顯示，ZjNAC2與粟(Setaria italica)的親緣關系最近(圖2)。同源比對結果顯示，ZjNAC2的氨基酸序列與慈竹(Bambusa emeiensis)、粟、高粱(Sorghum bicolor)的同源性較高(圖3)，相似度分別為73.66%、72.22%和71.58%。保守結構域分析表明，該基因編碼的蛋白在N端有一個典型的NAM結構域。綜上所述，試驗所獲得的ZjNAC2基因屬于NAC轉錄因子家族。

2.2 啟動子克隆與作用元件分析

以DNA為模板進行染色體步移，測序結果經序列比對正確后，用設計的啟動子特異性引物進行擴增，經瓊脂凝膠電泳檢測PCR擴增產物。經序列比對正確，克隆得到ZjNAC2基因啟動子序列，1 574 bp(圖4A)。用PlantCARE網站分析ZjNAC2啟動子上可能存在的潛在結合位點，如CAAT-box、TATA-box、脫落酸響應元件(ABRE)、赤霉素響應元件(CCTTTTG motif)、生長素響應元件(AACGAC motif)、HSE、MYB和TC-rich repeat等順式作用元件。這些順式作用元件可能響應植物激素、參與逆境脅迫防御應激相關的應答，調控植物的生長發育 (圖4B)。

圖1 ZjNAC2基因的克隆Figure 1 Molecular cloning of ZjNAC2

圖2 ZjNAC2遺傳進化分析Figure 2 Phylogenetic analysis of ZjNAC2

圖3 ZjNAC2同源性比對分析Figure 3 Sequences alignment analysis of ZjNAC2

2.3 亞細胞定位

圖4 啟動子的克隆及其作用元件分析Figure 4 Molecular cloning for isolating promoter,and cis-elements analysis

之前的預測結果顯示，ZjNAC2蛋白定位于細胞核中，為驗證該結果，通過農桿菌注射煙草，暗培養48 h之后，將注射后的本生煙草葉片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光蛋白的分布情況。結果發現，在激發場和融合場中轉35S-ZjNAC1-YFP的熒光信號能夠在細胞核中檢測到，而對照的熒光信號在整個細胞中均能被檢測到。試驗結果表明，ZjNAC2定位于細胞核中(圖5)。

2.4 基因表達分析

為了研究ZjNAC2在日本結縷草中的表達特征，以日本結縷草的根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉為材料，分別提取其總RNA，反轉錄成cDNA后進行熒光定量分析。結果顯示，ZjNAC2在日本結縷草根、莖、葉中均有表達，且在根中的表達量最高，約為莖中表達量的3倍，葉的1.5倍(圖6A)；ZjNAC2在日本結縷草葉片的不同發育時期表達量不同，在老葉中的表達量明顯高于幼嫩葉片和成熟葉片，約為幼嫩葉片中表達量的29倍，成熟葉片中的43倍(圖6B)。

為研究ZjNAC2在不同激素處理下的表達特征，對日本結縷草分別噴施ET、MeJA和ABA，分析ZjNAC2在24 h內的表達情況。結果表明，ET處理后，24 h內ZjNAC2的表達水平波動較大，在1 h時其表達量降到最低，約為初始表達量的4倍，3 h時回升，6 h時又降低隨后回升(圖6C)；MeJA處理后，在3 h時ZjNAC2基因的表達量降到最低，約為初始水平的2.5倍，隨后在6 h時表達量開始回升(圖6D)；ABA處理1 h后ZjNAC2的表達量降到最低，約為初始水平的3.25倍，3 h時表達量水平沒有發生明顯的變化，6 h后其表達量逐漸開始回升 (圖6E)。

圖5 ZjNAC2的亞細胞定位Figure 5 Subcellular localization of ZjNAC2

圖6 ZjNAC2表達特征分析Figure 6 Real-time quantitative PCR of ZjNAC2 expression characteristics

為探究ZjNAC2在干旱、高鹽脅迫下日本結縷草中的表達情況，用PEG、NaCl處理，分析ZjNAC2在24 h內的表達情況。結果表明，干旱處理1 h后ZjNAC2的表達量降低了93.75%，隨后逐漸開始回升，在12 h時ZjNAC2的表達量顯著上升，其表達量約為脅迫前的4.4倍(圖6F)；高鹽處理后，ZjNAC2的表達水平隨著處理時間的延長逐漸上升，在12 h時達到峰值，約為對照的4.8倍(圖6G)。

3 討論

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，不同的家族成員在植物發育過程和應激反應中具有不同的功能，其在擬南芥等模式植物中關于抗性脅迫方面的研究較為清楚，但在日本結縷草中的報道很少。本研究從日本結縷草中克隆得到了ZjNAC2基因，其編碼區全長1 110 bp，編碼369個氨基酸。通過蛋白保守結構域分析表明ZjNAC2編碼的氨基酸N端具有典型的NAM結構域，屬于NAC轉錄因子家族[17]。同源比對結果顯示C端結構差異明顯，不具有保守型，表明NAC轉錄因子通過有差異的C端來調控轉錄激活的。進化樹分析顯示，ZjNAC2與粟NAC的親緣關系最近。亞細胞定位結果顯示，ZjNAC2蛋白定位于細胞核中，與番茄SlNAC1[8]、水稻OsNAC3[18]、紫花苜蓿MsNAC2[19]的定位結果一致，表明ZjNAC2作為一個轉錄因子在細胞核中發揮作用。

啟動子是一類啟動基因表達的順式作用元件，位于結構基因5' 端上游的DNA序列，通過與特定的轉錄因子結合，調控基因的轉錄[20]。啟動子作為轉錄水平上重要的調控元件，在基因工程領域開發和分子網絡機制的研究具有重要的意義。研究發現，不同的NAC轉錄因子響應的元件不一樣，有的可以同時受不同的激素、非生物脅迫等調控[21]。本研究通過PCR擴增獲得了ZjNAC2基因1 574 bp的啟動子序列。對ZjNAC2上游啟動子序列的分析發現，除了具有典型的核心啟動子區域外，ZjNAC2啟動子還含有多個與激素、逆境誘導相關的元件和光反應相關元件，比如脫落酸響應元件ABRE、赤霉素響應元件CCTTTTG motif、生長素響應元件AACGAC motif、熱脅迫響應元件HSE以及參與干旱反應的MYB元件。這表明ZjNAC2基因可能參與了不同激素的信號傳導途徑，并受熱、光、干旱等多種外界環境因子的誘導調控，為進一步探究ZjNAC2的表達特征提供了依據。

組織特異性表達模式分析研究表明，ZjNAC2在不同的組織中均有表達，在根中的表達水平最高，顯著高于莖和葉中的表達量。研究結果與玉米(Zea mays)中的ZmNAM[22]、紫花苜蓿中的MsNAC2[19]的表達情況一致。孫志超等[23]對桑樹(Morus alba)中CUC1、NAC100a和NAC100b基因研究表明，CUC2在葉片中表達最高，而NAC100a和NAC100b在冬芽中表達最高。這表明不同的NAC家族成員在不同的組織表達量不同，在植物生長發育過程中發揮的功能可能不同。不同發育時期的葉片表達模式分析表明，ZjNAC2在老葉中的表達水平顯著高于幼葉、成熟葉片中的表達量，與擬南芥中AtNAC072的表達情況一致[3]。這表明ZjNAC2的表達可能與植物的葉片衰老有關，可能參與了葉片的衰老進程。

大量研究發現，NAC轉錄因子大部分都會受到多種生物和非生物脅迫的影響，響應多種激素和應答反應[9,24]。本研究中用ET處理日本結縷草后，ZjNAC2的表達模式表現為先下降后回升，之后在6 h時又下降后回升的波動趨勢，這與香蕉(Musa nana)中MaNAC5[25]的表達模式類似，推測ZjNAC2受乙烯的調控表達。乙烯可誘導香蕉果肉和果皮中的MaNAC1和MaNAC2表達，且與EIN3相互作用，而果皮中MaNAC6受乙烯的抑制[25]。這表明不同的NAC轉錄因子可受到乙烯的不同調控。噴施MeJA后，ZjNAC2的表達量在3 h時下降，12 h時又達到最高點，表明ZjNAC2的表達可受到MeJA的不同調節。研究發現許多NAC轉錄因子在擬南芥和水稻中調控其對非生物脅迫和ABA的響應[26-27]。本研究中噴施ABA和澆灌PEG后，ZjNAC2的表達水平在表現為先下降后回升的趨勢，表明ZjNAC2的表達受到ABA、干旱脅迫的調控，推測其可能參與日本結縷草響應ABA和干旱脅迫的調控途徑。這與擬南芥中ANAC019、ANAC055、ANAC072受干旱和脫落酸誘導的表達結果一致，在轉基因植物中明顯上調且耐旱性明顯增強[28]。這表明ABA和干旱脅迫可能誘導NAC轉錄因子表達，也可能下調其表達水平來增強或減弱植物的耐旱性。本研究中啟動子元件分析發現，ZjNAC2啟動子含有多個響應脫落酸和干旱脅迫的作用元件，因此ZjNAC2可能與植物的耐旱性有關，可以通過試驗進一步研究其調控機理。高鹽脅迫處理日本結縷草后，ZjNAC2的表達量逐漸上升，高鹽處理誘導ZjNAC2表達，這與擬南芥中的ATAF1[29]、水稻中的OsNAC6[30]、葡萄中的VvNAC1[10]研究結果一致。

4 結論

本研究從日本結縷草中克隆獲得了ZjNAC2的基因序列1 110 bp，編碼369個氨基酸。保守結構域分析表明ZjNAC2屬于NAC轉錄因子家族。同時通過染色體步移的方法獲得其1 574 bp的啟動子序列，通過作用元件分析發現該啟動子上有多個不同的響應元件。亞細胞定位結果顯示，ZjNAC2定位于細胞核。熒光定量表達分析表明，ZjNAC2在衰老葉片中的表達量最高，且ZjNAC2的表達受ET、MeJA、ABA及干旱和高鹽處理的調控。本研究結果表明，ZjNAC2轉錄因子可能參與多種信號傳導途徑，這為進一步深入研究其功能奠定了基礎。