α -單月桂酸甘油酯對致病菌的抑制作用

高振杰，郭錫欽

（1.北京大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100081；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為畜禽養(yǎng)殖中常見的致病菌，發(fā)病率較高，且能通過各種方式造成食品污染。其中大腸桿菌主要引起仔豬黃白痢，沙門氏菌引起仔豬副傷寒、雞白痢和禽傷寒等[1-2]。金黃色葡萄球菌常引起仔豬滲出性皮炎、牛羊乳房炎和子宮內(nèi)膜炎、犬貓鼻炎以及雞水腫病等多種動物疾病[3-5]。為預(yù)防和治療這3種細菌，養(yǎng)殖過程中大量不合理使用抗生素產(chǎn)生了許多耐藥菌株，已威脅到人類的健康，故尋找可抑制這些細菌生長的綠色飼料添加劑具有重要意義。

α-單月桂酸甘油酯（GML），又名十二酸單甘油酯，是可由月桂酸和甘油直接酯化得到的中鏈脂肪酸，也是一種親酯性非離子型表面活性劑。研究表明，GML 具有抑菌、抗病毒作用，且被美國FDA（食品與藥物管理局）認定為GRAS（一般公認安全）類食品添加劑。我國衛(wèi)生部也于2005 年4月批準(zhǔn)GML用于各類食品[6-8]。

研究表明，GML 可提高動物的生產(chǎn)性能以及免疫機能[9-10]。但是關(guān)于其抑制腸道致病菌方面的報道并不多。本試驗選取了大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌這3 種畜禽養(yǎng)殖中常見致病菌，通過牛津杯抑菌實驗和搖瓶實驗，探究一定濃度的GML 對這3 種菌的抑菌效果，為進一步合理利用GML提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品與菌種

GML 原料購自浙江惠嘉生物科技股份有限公司；大腸桿菌K88由浙江大學(xué)惠贈；雞白痢沙門氏菌（CVCC1791）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

GML溶液的配制：準(zhǔn)確稱取GML樣品2 g，用95%乙醇溶解成澄清溶液，定容至50 mL 容量瓶中，終濃度為40 mg·mL-1。

LB 液體培養(yǎng)基的配制：準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用ddH2O 定容至950 mL，用HCL 和NaOH 調(diào) 節(jié)pH 至7.0，再 用ddH2O定容至1 L，121 ℃滅菌30 min備用。

LB 固體培養(yǎng)基的配制：準(zhǔn)確稱取并加入LB 液體培養(yǎng)基的原料，再添加15 g 瓊脂粉，調(diào)pH 至7.0，定容滅菌備用。

菌種活化及菌液制備：分別將大腸桿菌k88、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌接種在LB 固體培養(yǎng)基上，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，挑取活化的細菌菌落，LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，用無菌水將菌落洗脫，充分振蕩，采用平板菌落計數(shù)法測定細菌數(shù)量，再制成1×106～1×107cfu·mL-1的懸浮液備用。

1.2.2 不同濃度的GML 對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌實驗方法

將40 mg·mL-1濃度的GML 溶液依次配比稀釋得到濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.0195 mg·mL-1的樣本液，并以95%乙醇溶液作為陰性對照。

牛津杯雙層平板擴散實驗：LB 固體培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至適當(dāng)?shù)臏囟龋瑹o菌條件下向已滅菌的培養(yǎng)皿（90 mm）加入LB 培養(yǎng)基15～20 mL進行封底，待第1層培養(yǎng)基充分冷卻凝固后，分別用滅菌移液器吸取已調(diào)好的供試菌0.1 mL（濃度106cfu·mL-1），將菌液接種至約45 ℃的LB 固體培養(yǎng)基，搖勻后迅速用移液管移取5～7 mL 含菌液的培養(yǎng)基至已凝固LB 培養(yǎng)基表面，并使菌液分布均勻。待第二層培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯（φ6×8×10 mm）置于LB 培養(yǎng)基表面，加入適當(dāng)量的樣品溶液，使液面高度與杯口持平。培養(yǎng)皿蓋上陶瓷蓋后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h。

使用菌落分析儀查看并測量每個培養(yǎng)皿中抑菌圈直徑的大小，根據(jù)抑菌圈直徑的判定標(biāo)準(zhǔn)進行敏感程度判定：抑菌圈直徑＞20 mm 為極度敏感，直徑15～20 mm為高度敏感；直徑10～15 mm為中度敏感；直徑7～9 mm 為低度敏感；抑菌圈直徑＜7 mm為不敏感；直徑越大，抑菌能力越強[11]。

1.2.3 GML 處理不同時間對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長抑制的試驗方法

配制LB 液體培養(yǎng)基500 mL，分裝至100 mL 錐形瓶中，每瓶50 mL，共分裝9瓶，滅菌冷卻備用。

接種之前，在超凈臺將培養(yǎng)瓶分為3 組，每組3個重復(fù)，組1為空白對照組，不添加任何菌與GML；組2為試驗組，接種適宜濃度（1×106cfu·mL-1）的菌液并添加GML 原料（終濃度為1 mg·mL-1）；組3 為對照組，只接菌不添加GML。加樣后用錫紙封蓋以防止污染。37 ℃，180 r·min-1于搖床上震蕩搖瓶，在培養(yǎng)時間為0、4、8、12、24 h 時取培養(yǎng)液1 mL，于96 孔板加樣200 μL·孔-1，每份樣3 個重復(fù)，采用酶標(biāo)儀在600 nm 波長處檢測OD 值。OD值越高，說明培養(yǎng)液越渾濁，菌的數(shù)量越多。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 進行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，使用LDS 法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GML 對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的影響

不同濃度GML 對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用見附表。

由附表可知，大腸桿菌對GML濃度≤40 mg·mL-1低度敏感，抑菌圈直徑與溶劑對照組相比無顯著差異；沙門氏菌對GML 濃度＜0.156 mg·mL-1低度敏感，對GML 濃度≥0.156 mg·mL-1中度敏感，GML濃度≥0.313 mg·mL-1抑菌圈直徑顯著＞0.156 mg·mL-1及以及下濃度GML 的抑菌圈直徑；金黃色葡萄球菌對GML 濃度≤0.039 mg·mL-1低度敏感，GML濃度≥0.078 mg·mL-1中度敏感，GML 濃度≥2.5 mg·mL-1高度敏感。

附表 不同濃度GML對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 GML處理時間對大腸桿菌生長的抑制效果

GML 處理不同時間對大腸桿菌生長的抑制作用見圖1。

圖1 GML處理不同時間對大腸桿菌生長的抑制作用

由圖1 可知，GML 對大腸桿菌無顯著抑菌作用，CML 組和對照組培養(yǎng)液OD 值均隨時間延長逐漸升高，在12 h后開始保持平穩(wěn)。

2.3 GML 處理不同時間對沙門氏菌生長的抑制效果

GML 處理不同時間對沙門氏菌生長的抑制效果見圖2。

由圖2可知，沙門氏菌組對照組和GML組培養(yǎng)液OD 值在培養(yǎng)8 h 前皆穩(wěn)定上升，在8 h 后兩者的OD 值出現(xiàn)一定差異，12～48 h 時兩者OD 值差異顯著（P＜0.05），36～48 h 時OD 值趨于平緩。結(jié)果表明，GML 對沙門氏菌生長有抑制效果，且抑制效果從12 h開始較為明顯。

圖2 GML處理不同時間對沙門氏菌生長的抑制作用

2.4 GML 處理不同時間對金黃色葡萄球菌生長的抑制效果

GML 處理不同時間對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用見圖3。

由圖3 可知，金黃色葡萄球菌對照組的培養(yǎng)液OD 值在8 h 之前快速升高，在8 h 之后保持平穩(wěn)增長；GML 組培養(yǎng)液OD 值在12 h 前無明顯升高，在12 h之后平緩升高，從4 h開始兩組間OD值表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，從4 h 開始，GML對金黃色葡萄球菌的生長有明顯的抑制作用。

圖3 GML處理不同時間對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用

3 討 論

α-單月桂酸甘油酯作為中鏈脂肪酸，在食品中應(yīng)用廣泛。研究表明，月桂酸及其單甘油酯抑菌效果優(yōu)于同類脂肪酸及其甘油酯[12]。其抑菌作用可通過與細菌細胞壁或生物膜結(jié)合影響其代謝，或是抑制芽孢類細菌的芽孢生長實現(xiàn)[13-14]。本試驗結(jié)果表明，GML 對屬于革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌有顯著抑制效果；而對革蘭氏陰性菌類的沙門氏菌有較強抑菌作用，但對大腸桿菌抑制效果相對偏弱，與前人研究結(jié)果基本一致[14]。試驗結(jié)果表明，GML 在體外對大腸桿菌抑制效果較差，可能與大腸桿菌種類或與試驗所用GML 濃度有關(guān)；GML 在金黃色葡萄球菌增殖前對其產(chǎn)生抑制作用，而對沙門氏菌的抑菌效果在12 h 后開始呈現(xiàn)差異，此現(xiàn)象或許與GML 跨越細胞膜的難易程度有關(guān)。由于芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的細胞壁多以肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖構(gòu)成，利于GML穿越細胞膜，通過破壞其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，影響膜代謝等方式發(fā)揮抑菌效果，因此其在細菌生長之初就能發(fā)揮抑制效果。而針對革蘭氏陰性菌，GML的抑菌效率相對較低，這可能與其膜表面的LPS脂多糖層有關(guān)。研究表明，革蘭氏陰性菌如變形桿菌和大腸桿菌質(zhì)膜的LPS被破壞后，GML對其抑制效率會顯著提升，因此實際應(yīng)用中常把GML 與LPS 干擾劑如EDTA 等制成凝膠混用以達到更好的抑菌效果[15]。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，GML 濃度≤40 mg·mL-1對大腸桿菌無顯著抑菌作用，≥0.156 mg·mL-1對沙門氏菌有抑制作用，≥0.078 mg·mL-1對金黃色葡萄球菌有抑制作用。1 mg·mL-1對金黃色葡萄球菌的抑制作用在培養(yǎng)4 h 出現(xiàn)，對沙門氏菌的抑制作用在培養(yǎng)12 h 出現(xiàn)，對大腸桿菌在培養(yǎng)48 h 內(nèi)無抑制作用。綜上所述，GML 對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，沙門氏菌次之，大腸桿菌幾乎無作用。