糖基化亞硝基血紅蛋白色素特性的研究

張軍，王英平，王建化*

(1.青島農業大學 海都學院，山東 萊陽 265200；2.黃島海關，山東 黃島 266000)

亞硝基血紅蛋白可以作為發色、發香劑應用在肉品加工中，以減少亞硝酸鹽的使用量[1]，但其中的色素物質易受環境影響發生降解及褪色。因此，使用蛋白質糖基化反應來合成制備糖基化亞硝基血紅蛋白色素，以提高其物化特性，并降低其使用量，保持色澤。

1990年，有研究者試著通過美拉德反應制備蛋白與糖的復合物改善蛋白化學改性的弊端[2]。2005年，楊錫洪以血紅蛋白制備色素替代亞硝酸鹽發色的研究，確定了亞硝基糖基化的最佳條件。還有研究者研究了乳清蛋白糖基化反應特性及抗氧化性等，采用7種不同的糖基配體，對乳清蛋白與不同糖基復合物反應特性及抗氧化特性進行研究[3]。彭善麗、張根義進行了茶多酚對蛋白質糖基化作用的研究，通過測定小鼠血清中的糖化血紅蛋白和糖基化的最終產物熒光強度的變化情況來了解茶多酚對高糖機體內糖基化蛋白質的作用[4]。2015年，李飛等人對糖基化亞硝基蛋白的穩定性及其在豬肉脯中的應用進行了探究[5]。

糖化蛋白是生物化學現象，但把糖化蛋白的功能特性應用于食品工業是一個嶄新的研究領域。本實驗采用新鮮豬血為原料，制備血紅蛋白，一定條件下與亞硝酸鹽反應生成亞硝基血紅蛋白，經糖基化得到糖基化亞硝基血紅蛋白色素，探究糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性和穩定性的影響因素。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

新鮮豬血：購自萊陽龍大現取豬血；檸檬酸鈉、亞硝酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉：均為分析純，萊陽康德化工有限公司；氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀：均為1.0 mol/L標準溶液，國藥集團化學試劑有限公司；可溶性殼聚糖：標準試劑，濟南海得貝海洋生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

JY92-IIYJ超聲波細胞破碎儀 南京以馬內利儀器設備有限公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析實驗儀器有限公司；PL4001-L分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；H-1650離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 糖基化亞硝基血紅蛋白色素的制備流程

糖基化亞硝基血紅蛋白色素的制備流程見圖1。

圖1 糖基化亞硝基血紅蛋白色素制備流程圖Fig.1 Flow chart for preparation of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

2.1.1 血紅蛋白的制備

將從萊陽龍大公司取出的新鮮豬血，加入15%的檸檬酸鈉溶液，然后在0～-5 ℃環境下冷藏10～24 h。

將冷藏的新鮮豬血取出離心(3000 r/min，15 min)。

將上清液倒掉，取下層沉淀，加入少量蒸餾水，攪拌5 min,在細胞破碎儀中破碎，破碎溫度60 ℃、破碎時間12 min、破碎頻率2/3，然后以1.0 mol/L的鹽酸調節pH值至6.2。

2.1.2 亞硝基血紅蛋白的制備

取已調節好pH值的血紅蛋白溶液1000 mL,添加8 g亞硝酸鈉和3.6 g異抗壞血酸鈉，然后攪拌均勻。

將攪拌均勻后的溶液在35 ℃恒溫水浴鍋中加熱2～3 h，離心(3000 r/min,15 min)除去殘渣，得到亞硝基血紅蛋白溶液[6]。

2.1.3 糖基化亞硝基血紅蛋白色素的制備

添加可溶性殼聚糖(可溶性殼聚糖溶液濃度∶亞硝基血紅蛋白濃度為1∶5)，均勻后，以鹽酸溶液將pH值調至5.0。

將調節好的溶液于60 ℃恒溫水浴鍋內緩慢攪拌，時間20 min，反應完全后離心，除去沉淀。

將所制得的亞硝基血紅蛋白和糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶液平均分成兩組，一組放在60 ℃的烘箱中烘干，另外一組經冷凍干燥制成凍干粉。

用研缽將烘干和凍干的亞硝基血紅蛋白色素和糖基化亞硝基血紅蛋白色素研成粉末，冷藏備用。

2.2 糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性的測定

2.2.1 干燥方式對糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性的影響

將真空冷凍干燥和60 ℃條件下烘干的糖基化亞硝基血紅蛋白色素粉末分別稱取1.0 g，然后用量筒分別量取10 mL的蒸餾水，于燒杯中進行溶解，觀察其溶解性的變化。

2.2.2 溫度對糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性的影響

將糖基化亞硝基血紅蛋白色素各0.1 g置于燒杯中，然后用量筒分別量取10 mL在室溫、60 ℃、80 ℃等條件下加熱的蒸餾水，在燒杯中溶解，然后觀察不同溫度下的溶解情況。

2.3 糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的測定

2.3.1 不同貯藏溫度對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

將糖基化亞硝基血紅蛋白色素粉色素置于密封袋中，于室溫、4 ℃、-18 ℃條件下避光貯藏，每隔24 h取0.1 g，加入10 mL丙酮溶液后過濾，于波長540 nm處測定濾液的吸光度[7]。

2.3.2 光照對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

將1.0 g糖基化亞硝基血紅蛋白色素放置于室外光、室內自然光、室內暗處等未封閉培養皿中，一定時間各取0.1 g色素，加入10 mL丙酮溶液后過濾，于波長540 nm處測定其吸光度。

2.3.3 氧化劑對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響[8]

向10 mL不同濃度的過氧化氫溶液中各加入1.0 g糖基化亞硝基血紅蛋白色素，避光放于暗處，每隔24 h，觀察樣品的顏色變化情況，離心沉淀，加入10 mL丙酮溶液過濾，于波長540 nm處測定吸光度。

2.3.4 金屬離子對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

將1.0 g糖基化亞硝基血紅蛋白色素，分別與10 mL濃度為1.0 mol/L的各種金屬離子，如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣以及氯化鎂溶液混合，以水為對照樣，密封后置于暗處，在不同時間觀察樣品在氯化鈣溶液中的顏色變化，離心沉淀，加入10 mL丙酮溶液后過濾，于波長540 nm處測吸光度。

2.3.5 溫度對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

將1.0 g糖基化亞硝基血紅蛋白色素，在溫度為75，85，95 ℃條件下恒溫水浴加熱15 min，觀察其色澤變化情況。

3 實驗結果

3.1 不同處理方式對糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性的影響

3.1.1 干燥方式對糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性的影響

表1 不同干燥方式對色素溶解性的影響Table 1 Effects of different drying methods on the solubility of pigments

由表1可知，不同的干燥條件下糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性不同，真空冷凍條件下，糖基化亞硝基血紅蛋白色素完全溶解而且速度快，因真空凍干條件下不影響色素原有的結構，其復水性強。

3.1.2 溫度對糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶解性的影響

表2 不同溫度條件下對色素溶解性的影響Table 2 Effects of different temperatures on the solubility of pigments

由表2可知，糖基化亞硝基血紅蛋白色素的溶解性在室溫、60 ℃時高于80 ℃時的溶解性，且60 ℃比室溫時溶解性略好，因其溫度較低溶解不夠充分，溫度過高，蛋白質容易發生變形。由此可見，糖基化亞硝基血紅蛋白色素適宜在60 ℃下溶解。

3.2 影響糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的因素

3.2.1 貯藏溫度對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

圖2 糖基化亞硝基血紅蛋白色素貯藏穩定性變化Fig.2 Changes of storage stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由圖2可知，在540 nm處測定3種貯藏溫度下糖基化亞硝基血紅蛋白色素吸光度的變化。在-18 ℃條件下糖基化亞硝基血紅蛋白色素吸光度最大并且變化幅度較小，4 ℃次之，而室溫下吸光度明顯降低。所以，糖基化亞硝基血紅蛋白色素最好在低溫條件下貯藏。

3.2.2 光照對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

圖3 光照對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.3 Effects of illumination on the stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由圖3可知，光照條件變化，其吸光度變化情況存在差別。在室內暗處，糖基化亞硝基血紅蛋白色素吸光度最大并且變化幅度較小，而在室外光照下，吸光度明顯降低且變化幅度明顯增大，室內自然光照下介于兩者之間。由此可得，室內暗處糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性優于其他兩種情況。

3.2.3 不同濃度氧化劑對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

圖4 氧化劑對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.4 Effects of oxidants on the stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由圖4可知，糖基化亞硝基血紅蛋白色素在不同濃度的過氧化氫溶液下吸光度發生了明顯的變化。起始時間,糖基化亞硝基血紅蛋白色素在不同濃度的過氧化氫溶液中吸光度都明顯下降并且下降幅度較大，兩種溶液下吸光度非常相近，但隨著時間的延長，20%過氧化氫的下降幅度增大，而15%過氧化氫的下降幅度減緩。由圖4可知，氧化劑對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性有較大影響，并且隨過氧化氫濃度的增大而呈現增大的趨勢。總而言之，氧氣是糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的一個重要因素。

3.2.4 金屬離子對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響

圖5 金屬離子對糖基化亞硝基血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.5 Effects of metal ions on the stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由圖5可知，糖基化亞硝基血紅蛋白色素在氯化鎂溶液中吸光度最大并且變化幅度較小，在氯化鈉和氯化鉀溶液中兩者吸光度變化曲線基本相同，在氯化鈣溶液中糖基化亞硝基血紅蛋白色素溶液吸光度值最小。由此可見，金屬離子也是影響色素穩定性的一個方面，Ca2+相對于Na+、K+、Mg2+而言，穩定性明顯偏差。

4 結論

本實驗研究了影響色素溶解性和穩定性的重要因素。糖基化后的色素具有溶解性更好、穩定性更高等特點，這也是人們在生產中考慮是否將糖基化亞硝基血紅蛋白色素應用于食品肉制品加工中的重要因素。本實驗在干燥方式和溫度等方面對糖基化亞硝基血紅蛋白色素的溶解性進行了探究，對不同貯藏溫度、光照和氧化劑以及金屬離子對糖基化亞硝基血紅蛋白色素的穩定性進行了探究。結果證明，糖基化亞硝基血紅蛋白色素在真空冷凍干燥、60 ℃條件下溶解性較好，在-18 ℃貯藏、室內暗光、15%過氧化氫、氯化鎂溶液中穩定性較強。