降鈣素相關基因肽在小鼠巨噬細胞炎癥調控中的作用研究

肖美芳，林樟萍，陸喆，劉乾坤

（海南省婦幼保健院 檢驗科，海南 海口 570206）

降鈣素相關基因肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）是由感覺神經元釋放的一種肽類物質[1]。已有研究證實CGRP 具有顯著的抗炎效果[2-3]，其通過抑制T 淋巴細胞的增殖，并且抑制巨噬細胞產生促炎因子，從而調節炎癥反應[4]。核苷酸結合低聚體結構域樣受體3（nucleotides binding oligomer domain like receptors 3,NLRP3）作為炎癥反應中的炎癥小體[5]，主要在外周單核巨噬細胞和腦內小膠質細胞中表達[6]。活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）被認為是最重要的激活炎癥小體NLRP3 的因素[7-8]。NLRP3 炎癥小體在ROS激活后能夠活化半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），使炎癥因子成熟并釋放到胞外以發揮作用[9]。因此可推測CGRP 可能作為調控者通過ROS 使NLRP3 活性降低，從而減少局部炎癥反應。基于此，本研究對該推測進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

大腸桿菌0111：B4 的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（美國Sigma 公司），CGRP（南京肽業生物科技有限公司），兔抗NLRP3、Caspase-1、白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗體（美國Santa 公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司），Taq Man逆轉錄試劑盒（美國Life Technologies 公司），小鼠源性IL-1β 和TNF-α 的酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢 測試劑盒（美國EXCEL 公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）試劑盒（美國Gene Copoeia 公司），Bio Rad IQTM 5 Multicolor 實時熒光定量系統（美國Bio Rad 公司），紫外可見分光光度計（美國Thermo 公司，型號Nanodrop 2000），Multiskan MK 3 酶標儀（美國Thermo），FACS Canto Ⅱ流式細胞儀（美國BD），倒置熒光顯微鏡Nikon IX71，Image-Pro Plus 7.0 成像系統（日本Olympus 公司）。

1.2 細胞培養、分組及處理方法

RAW264.7 巨噬細胞（中國科學院上海細胞庫），所用培養液為含10% FBS（杭州四季青生物材料有限公司），含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的雙抗α-MEM 培養基（美國Gibco 公司），于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中常規培養。……