DAPT對肺纖維化小鼠Th17細胞分化的影響*

徐芳，王愛利

（武漢市第一醫院 呼吸科，湖北 武漢 430022）

肺纖維化（pulmonary fibrosis）是一種病因未明、發病機制復雜的彌漫性肺部疾病[1]，目前公認是肺損傷后過度修復導致細胞外基質過度沉積的結果。課題組前期研究顯示，肺纖維化中輔助性T 細胞17（T helper cell 17,Th17）的高表達與肺纖維化進展呈正相關[2]。本研究發現，NOTCH 信號通路在肺纖維化中被激活，促進成纖維細胞表型轉化[3]，加重細胞外基質的沉積。Th17 高水平分泌和表達白細胞介素-17（Interleukin 17,IL-17）的過程受多種信號通路的調控。有研究表明，在小鼠和人促Th17 細胞分化的細胞因子環境中均有NOTCH 信號通路的活化[4]。本研究采用γ-分泌酶抑制劑DAPT 阻斷NOTCH 信號通路，探討NOTCH 信號通路對肺纖維化模型小鼠Th17細胞的影響，為肺纖維化治療尋找新的免疫靶向藥物提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取15 只雄性昆明鼠（批號：42000600006205），體重約25 ～30 g，購自武漢大學動物中心；博來霉素（4 mg/支，天津太和制藥有限公司，批號：081102），DAPT（美國Sigma 公司），鼠α- 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、NOTCH 1 及IL-17 等相關抗體（美國Santa Crue 公司）；酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（美國R &D 公司），Quantscript RT Kit 逆轉錄試劑盒（大連TaKaRa 公司），SYBR Green/Floursecein試劑盒（立陶宛Fermentas 公司），異硫氰酸熒光素標記的CD3、CD4 抗體及藻紅蛋白標記的IL-17A 單克隆抗體（美國eBioscience 公司）。

1.2 動物模型的復制及實驗分組

按隨機數字表法分為3 組：對照組、模型組及DAPT組，每組5只。各組小鼠用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射，麻醉后固定于手術臺上，頸部氣管切開注藥。對照組注入生理鹽水（1.25 ml/kg）設立陰性對照，模型組及DAPT 組注入博來霉素（5 mg/kg），DAPT 組于模型復制次日起開始用DAPT 溶液灌胃[5 mg/（kg·d）]，隔天1 次，直到處死。……