慈菇消脂丸對非酒精性脂肪性肝病大鼠NF-κB和iNOS表達的影響*

馬燕花，楊少軍，師 霞，白洲霞，邱曉青

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730101； 2.北海市中醫醫院，廣西 北海 536000；3.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)發病機制復雜，涉及脂代謝紊亂、胰島素抵抗、肝脂質過氧化增加、細胞因子異常等多個相互關聯的病理生理環節，但均可納入Day和Tames于1998年提出的“二次打擊”學說[1]。第一次打擊以胰島素抵抗為主；第二次打擊以氧化應激及炎性反應為主，在NAFLD的疾病進展中起到重要作用[2-3]。過度蓄積的游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)發生脂質過氧化，產生大量的活性氧，導致肝組織核轉錄因子kappa B(nuclear factor-κB, NF-κB)的活化和表達增強，最終引發肝細胞氧化應激損傷和脂性凋亡[4-5]。本研究通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，用慈姑消脂丸進行干預，檢測肝組織NF-κB和NF-κB誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達，探討慈姑消脂丸對NAFLD的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質量(200±20)g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(甘)2015-0002。適應性喂養1周，飼養于甘肅中醫藥大學實驗動物中心，室內溫度(22±2)℃，濕度50%～ 60%，12 h光照維持，晝夜循環，自由攝食飲水，普通飼料喂養。本實驗遵循甘肅中醫藥大學實驗動物中心實驗動物使用管理規定，并通過甘肅中醫藥大學動物倫理委員會批準，倫理編號：2015-0361。

1.2 藥品、試劑與儀器

慈菇消脂丸處方組成：山慈菇、法半夏、茯苓、柴胡、丹參、土鱉蟲、薏苡仁、黃芩、澤瀉、枸杞、生山楂等14味中藥。中藥材由甘肅中醫藥大學附屬醫院制劑中心提供，委托甘肅中醫藥大學附屬醫院制劑室的王曉莉主任藥師鑒定為正品。制劑以水為溶媒提取(正交實驗)再濃縮，將不適合提取的藥物進行粉碎，加入到濃縮液中，制成半濃縮型水丸，規格60 g/瓶，每丸質量0.135 g，相當于生藥材0.252 g。鹽酸吡格列酮片，規格15 mg，7片/盒，北京太洋藥業股份有限公司產品，批次號161101。高脂飼料(普通飼料+15%豬板油+2%膽固醇+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉)、普通飼料(總熱量15.335 J/g，其中碳水化合物熱卡占53%，脂肪熱卡占9%，蛋白質熱卡占20%)，均由北京科澳協力飼料有限公司提供，真空包裝成10 kg/袋。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號13352801)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號14640501)、總膽固醇(TC)試劑盒(批號13585401)、三酰甘油(TG)試劑盒(批號14854801)，均購自于德國羅氏(Roche)診斷公司；焦碳酸二乙酯 (diethyl pyrocarbonate，DEPC)， 購自Amresco公司，批號E174；Trizol(批號9109)、qPCR反應試劑盒(批號RR420A)、反轉錄試劑盒(批號RR047A)，均購自日本Takara公司；兔抗大鼠β-actin抗體(批號ab8227)、兔抗大鼠NF-κB抗體(批號ab32360)、兔抗大鼠iNOS抗體(批號ab15323)，均購自Abcam公司；大范圍蛋白定量試劑盒，購自Sigma公司，批號93736；蛋白Marker，購自Thermo公司，批號26634。Alcyon 300型全自動生化分析儀，美國雅培公司產品；AlphaImager 2200型凝膠成像分析系統，美國Alpha公司產品；Mx3005P型實時定量PCR擴增儀，美國Agilent公司產品；PowerPac Universal型電泳儀、Mini Protean 3 Cell型電泳槽，伯樂小型Trans-Blot轉印槽，均為美國Bio-Rad公司產品；VANOXAHB-LB型OLYMPUS萬能顯微鏡，日本OLYWPUS公司產品；HITACHI-HS500透射電鏡，日本HITACHI公司產品。

1.3 模型的建立與分組

參照文獻[6]方法，采用高脂飼料喂養制備NAFLD模型。取Wistar大鼠60只，以基礎飼料適應性喂養1周后，按體質量編號，以隨機數字表法隨機分為正常對照組(10只)和造模組(50只)2組。正常對照組給予普通飼料喂養，造模組給予高脂飼料喂養，至第12周末造模結束，通過肝臟的病理變化確定造模成功與否。模型復制成功的標準如下。肉眼觀察：造模組大鼠肝臟明顯腫大，呈黃色缺血狀。HE染色、鏡下觀察：造模組大鼠肝小葉結構破壞；肝細胞彌漫性脂肪變性，脂滴大小不等，部分融合為大脂滴，界限不清；肝索紊亂，少數可見點狀壞死，碎屑狀壞死和炎性細胞浸潤。將造模成功大鼠隨機分為模型對照組，慈菇消脂丸高、中、低劑量組，鹽酸吡格列酮片組，每組10只，開始灌胃給藥。慈菇消脂丸高、中、低劑量組依次灌胃慈菇消脂丸水煎劑6.48，3.24，1.62g/kg體質量，鹽酸吡格列酮片組灌胃鹽酸吡格列酮片1.35g/g體質量，正常對照組和模型對照組每日灌胃等容量的生理鹽水。灌胃體積為10 μL/g體質量，1 d 1次。連續灌胃給藥6周。

1.4 檢測指標

灌胃結束后，動物禁食24 h，次日用質量分數30 g/L的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，分離血清用于測定生化指標；收集肝臟標本，經冷生理鹽水清洗后鋁箔包裹置于液氮內速凍，保存于-80 ℃冰箱。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測定iNOS mRNA表達，Western-Blot法測定NF-κB、iNOS蛋白表達水平。

1.4.1 肝功能與血脂

使用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)活性。

1.4.2 iNOS mRNA表達

采用Real-time PCR。取約100 μg肝組織，用Trizol法提取總 RNA，經超微量分光光度計測定樣品的質量分數(μg/L)。檢測 A260/A280的比值在1.8～2.1，提示RNA質量較好。取1 μg RNA樣品用于合成cDNA。按照Real-time PCR試劑盒說明對iNOS進行PCR擴增，iNOS mRNA檢測所需引物根據標準Real-time PCR引物設計原則，由大連寶生物工程有限公司設計并合成，見表1。反應條件：95 ℃預變性30 s后，開始40個循環的PCR反應(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s)，溶解曲線制備60 ℃-95 ℃，0.5 ℃/s。靶基因相對表達量用 2-ΔΔct計算。

表1 iNOS基因Real-time PCR檢測引物序列

1.4.3 NF-κB、iNOS蛋白表達

采用Western-Blot法檢測。取20 mg左右冷凍的肝臟組織樣本，剪碎，加入RIPA組織裂解液提取各組肝組織總蛋白，每個樣本取出20 μL蛋白液進行蛋白定量，定量后每個泳道上樣20 μL于SDS-PAGE，電泳后轉至PVDF膜，取出PVDF膜，封閉結束后，將膜置于按1∶1 000稀釋的一抗溶液中，4 ℃搖床輕搖孵育12 h，然后轉入按1∶5 000稀釋的二抗溶液中，室溫搖床孵育120 min。等比例混合ECL化學發光液，均勻滴加在清洗完畢的PVDF膜表面，以保鮮膜包覆封裝后放置于暗盒中，在暗室中顯影曝光。

1.4.4 肝組織形態學

取部分肝組織用40 g/L多聚甲醛固定，常規制備組織石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠肝功能和血脂對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平明顯升高，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，慈菇消脂丸高、中劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平降低 (P<0.01)；慈菇消脂丸低劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG均明顯降低(P<0.01)，LDL-C活性無顯著變化(P﹥0.05)；鹽酸吡格列酮片組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C活性明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠肝功能和血脂對比

組 別劑量/(g·kg-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)正常對照組11.92±0.9760.50±10.331.36±0.230.62±0.380.29±0.15模型對照組98.63±64.15??130.63±54.99??1.87±0.32??1.44±0.75??0.67±0.15??鹽酸吡格列酮片組0.001 3547.13±10.21##74.20±25.13##1.47±0.36#0.86±0.38##0.43±0.23#慈菇消脂丸高劑量組6.4836.80±10.27##59.00±5.66##1.18±0.42##0.75±0.46##0.30±0.14##慈菇消脂丸中劑量組3.2445.43±18.30##71.67±29.79##1.39±0.51##0.65±0.31##0.12±0.24##慈菇消脂丸低劑量組1.6234.62±8.00##80.00±25.67##1.09±0.32##0.76±0.42##0.51±0.26

注：與正常對照組對比，** P<0.01；與模型對照組對比， # P<0.05， ## P<0.01

2.2 各組大鼠肝組織iNOS mRNA表達對比

模型對照組大鼠肝組織中iNOSmRNA的水平明顯高于正常對照組，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，慈菇消脂丸低、中、高劑量組及鹽酸吡格列酮片組中iNOSmRNA的水平均顯著下降(P<0.01)。慈茹消脂丸各劑量組與鹽酸吡格列酮片組對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.3 各組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達增加，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比 ，慈菇消脂丸高、中劑量組和鹽酸吡格列酮片組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達均顯著降低(P<0.01)；慈菇消脂丸低劑量組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.01)，但iNOS蛋白表達無顯著變化(P﹥0.05)。慈菇消脂丸高劑量組在下調NF-κB蛋白表達方面作用優于鹽酸吡格列酮片組，差別有統計學意義(P<0.01)。見表4、圖1。

組 別劑量/(g·kg-1)iNOS mRNA 正常對照組0.14±0.03模型對照組1.00±0.00??鹽酸吡格列酮片組0.001350.32±0.11##慈菇消脂丸高劑量組6.480.44±0.38##慈菇消脂丸中劑量組3.240.30±0.18##慈菇消脂丸低劑量組1.620.27±0.03##

注：與正常對照組對比，** P<0.01；與模型對照組對比，## P<0.01

組 別劑量/(g·kg-1)NF-κB/β-actin/蛋白相對表達量iNOS/β-actin/蛋白相對表達量正常對照組0.30±0.080.05±0.02模型對照組0.94±0.09??0.48±0.02??鹽酸吡格列酮片組0.001350.21±0.01##0.07±0.03##慈菇消脂丸高劑量組6.480.01±0.00##△△0.13±0.07##慈菇消脂丸中劑量組3.240.33±0.04##0.34±0.02##慈菇消脂丸低劑量組1.620.39±0.10##0.38±0.06

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01；與 鹽酸吡格列酮片組對比，△△P<0.01

A.正常對照組；B.模型對照組；C.鹽酸吡格列酮片組；D.慈菇消脂丸低劑量組；E.慈菇消脂丸中劑量組；F.慈菇消脂丸高劑量組圖1 各組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達

2.4 各組大鼠肝臟病理組織學對比

正常對照組大鼠肝小葉結構完整，肝索、肝竇分布正常，肝細胞形態一致。模型對照組大鼠肝被膜增厚，肝細胞彌漫性水腫和脂肪變性，間質少量纖維組織增生。慈菇消脂丸各劑量組大鼠肝小葉結構基本正常，高、中劑量組肝小葉內肝細胞散在脂肪變性；低劑量組局灶性肝細胞水腫、變性，少量炎性細胞浸潤。鹽酸吡格列酮片組大鼠肝小葉結構基本正常，肝細胞散在脂肪變性，少量炎性細胞浸潤。見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C慈菇消脂丸高劑量組；D.慈菇消脂丸中劑量組；E. 慈菇消脂丸低劑量組；F.鹽酸吡格列酮片組圖2 各組大鼠肝臟病理組織學對比(HE，×200)

3 討 論

研究[7-8]表明，脂肪酸及其代謝產物過度沉積在肝臟及血管內皮細胞等非脂肪組織可以造成NAFLD和血管功能障礙等疾病。其中FFA是引起脂毒性的重要介質，FFA誘導的脂毒性在NAFLD發病機制中發揮著中樞性作用[9]。NAFLD中存在高游離脂肪酸血癥，可促進胰島素抵抗、脂質過氧化反應，進而使活性氧水平上升，導致NF-κB的活化和表達增強，最終引發炎癥反應[10]。同時，NF-κB還可激活肝臟枯否細胞，釋放大量活性氧，并增強氧化應激，加重肝臟的炎癥反應和損傷[11]。

NF-κB是一種轉錄調控因子，1986年由Sen和Baltimore 首先發現廣泛存在于真核細胞中，通過調節免疫、炎癥遞質的表達和炎癥相關因子，在氧化應激、免疫反應、肝組織的炎性反應、肝細胞凋亡中起重要作用[12-13]。NF-κB最常見的形式是由p50與p65亞基組成的異二聚體。生理狀態下，NF-κB與抑制因子IκB單體偶聯，以無活性的形式存在于細胞質中。在炎癥、缺血缺氧、腫瘤、毒素等多種刺激下，IκB磷酸化后降解，NF-κB二聚體與 IκB 分離，NF-κB得以由胞質轉移到核內與靶基因序列上特定的結合位點結合，啟動或調節基因轉錄，誘導iNOS的過量表達[14]。高表達的iNOS產生高濃度的NO，NO可通過多種機制導致DNA損傷。

NAFLD屬中醫學“肥氣”“癥積”“痰濁”范疇。長期嗜食肥甘厚味，飲酒過度；或久臥久坐，體豐痰盈；或七情內傷，調攝失當；或因不慎感受濕熱疫毒，使脾失運化，肝失疏泄，以致水谷不能化為精微，聚而為濕為痰，化為濕濁脂毒，阻于肝絡，客于肝臟而形成本病。此符合中醫學“濁毒致病”學說[15]。慈菇消脂丸是課題組自擬的中藥處方。方中山慈菇起化痰解毒、消脂散結的作用，澤瀉、山楂祛脂化濁，丹參、土鱉蟲逐瘀通絡，柴胡、黃芩、法半夏疏肝理脾，決明子清肝降脂。整個組方立法以解毒化痰、消降濁脂為主。課題組前期的研究[16]表明：NAFLD大鼠肝組織中iNOS和NO的表達量顯著增加；采用慈菇消脂丸干預后，模型大鼠肝組織脂肪變性程度明顯減輕，iNOS和NO表達量顯著下降。同時，課題組另一項研究表明，NAFLD大鼠肝組織中NF-κB表達顯著增加，且通過線粒體細胞凋亡途徑介導肝細胞凋亡，慈菇消脂丸對其有干預效應，但慈菇消脂丸是否通過NF-κB信號通路活化iNOS從而干預NAFLD肝細胞脂性凋亡尚不清楚。

本實驗通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，給予不同劑量慈菇消脂丸干預，以鹽酸吡格列酮片作為陽性對照。結果顯示：大鼠造模12周出現嚴重的肝脂肪變性，少量纖維化及肝細胞凋亡。模型對照組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C均顯著高于正常對照組(P<0.01)，除慈菇消脂丸低劑量組對LDL-C表達無影響外，慈菇消脂丸中、高劑量組及吡格列酮片組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C均顯著低于模型對照組(P<0.05)。結果表明：造模后NAFLD大鼠血清中的脂質水平顯著增高，給予慈菇消脂丸灌胃能顯著改善肝功能、降低血脂，具有治療脂肪肝的作用。同時，模型對照組大鼠比正常對照組NF-κB、iNOS水平均明顯升高(P<0.01)；慈菇消脂丸高、中劑量組及吡格列酮片組均能顯著降低NF-κB、iNOS蛋白表達(P<0.01)，且慈菇消脂丸高劑量組在降低NF-κB蛋白方面作用明顯優于鹽酸吡格列酮組(P<0.01)。上述結果說明，慈菇消脂丸具有改善肝功能、降低血脂作用，其作用機制與調控NF-κB/iNOS信號通路相關蛋白表達有關。