HPLC法同時(shí)測定胎樂顆粒中5種成分含量

潘濤　歐陽波　蔡霈　楊磊　張志國　肖作奇

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定胎樂顆粒中5種成分（甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲）的含量。 方法 梯度洗脫，乙腈-0.1%磷酸水溶液為洗脫體系，檢測波長270 nm，總流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為30℃。 結(jié)果 甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲分別在1.96～19.58 μg/mL（r = 0.9999）、1.65～16.52 μg/mL（r = 0.9998）、11.71～117.12 μg/mL（r = 0.9999）、1.63～16.26 μg/mL（r = 0.9999）和1.23～12.28 μg/mL（r = 0.9999）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率（RSD）分別為101.75%（0.98%）、102.32%（1.70%）、98.03%（1.35%）、99.52%（1.54%）和100.12%（1.27%）。 結(jié)論 該方法簡單易行，可用于胎樂顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 胎樂顆粒;高效液相色譜;含量測定;黃芩苷;金絲桃苷

[中圖分類號(hào)] R917 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）05（c）-0100-05

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination on the contents of five constituents （liquorice， hyperoside， baicalin， baicalein and schisandrin） in Taile Granules. Methods The acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was eluted by gradient elution. The detection wavelength was 270 nm， the total flow rate was 1.0 mL/min， the injection volume was 10 μL， and the column temperature was 30℃. Results Liquorice， hyperoside， baicalin， baicalein and schisandrin showed good linear relationships within the ranges of 1.96-19.58 μg/mL （r = 0.9999）， 1.65-16.52 μg/mL （r = 0.9998）， 11.71-117.12 μg/mL （r = 0.9999）， 1.63-16.26 μg/mL （r = 0.9999） and 1.23-12.28 μg/mL （r = 0.9999）， whose average recoveries （RSD） were 101.75% （0.98%）， 102.32% （1.70%）， 98.03% （1.35%）， 99.52% （1.54%） and 100.12% （1.27%）， respectively. Conclusion This method is simple and can be used for the quality control of Taile Granules.

[Key words] Taile Granules; High performance liquid chromatography; Content determination; Baicalin; Hyperoside

胎樂顆粒是湖南省婦幼保健院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芩、菟絲子、山藥、墨旱蓮、五味子、甘草等十味中藥組成，具有固腎安胎功效，臨床上用于先兆流產(chǎn)的治療，療效顯著[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證明，黃芩具有抑制子宮平滑肌收縮的作用[2]，菟絲子有修復(fù)及保護(hù)卵巢功能的作用[3]，甘草有鎮(zhèn)靜解痙作用[4]，五味子具有益腎養(yǎng)心的功效，全方配合起到固腎調(diào)沖安胎的作用。本課題組前期研究僅對(duì)胎樂顆粒中1種成分黃芪甲苷的含量進(jìn)行了質(zhì)量控制[5]，尚無多指標(biāo)含量測定的方法，不能對(duì)該制劑形成較為全面的質(zhì)量控制。基于此，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-15]，本研究選用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)方中甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素、五味子醇甲等5種成分的含量進(jìn)行測定，為其質(zhì)量控制提供方法學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津，LC-10AT型）;二極管陣列檢測器（日本島津，SPD-M20A型）;色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent TC-C18）;電子分析天平（Mettler Toledo，d = 0.01 mg）;超聲清洗器（寧波新芝生物科技有限公司，SB-80）。

1.2 試藥

水（娃哈哈純凈水）;乙腈、甲醇（Tedia，色譜純）。胎樂顆粒（批號(hào)：20180401、20180416、20180412）由湖南省婦幼保健院藥學(xué)制劑部提供。甘草苷（161013-160724）、金絲桃苷（111521-201507）、黃芩苷（110715-200514）、黃芩素（111595-200604）、五味子醇甲（110857-201211）等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于中國食品藥品檢定研究院。黃芩、菟絲子、山藥、墨旱蓮、五味子、甘草等中藥飲片購自衡東縣中藥飲片廠（由湖南省中醫(yī)院王竹鑫主任中藥師驗(yàn)收合格）。其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液。檢測波長270 nm。總流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為30℃。梯度洗脫程序見表1，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 ?分別精密稱取甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，于不同容量瓶中，甲醇定容，即為對(duì)照品溶液。另稱取甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，于同一容量瓶中，甲醇定容，甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲溶度分別為9.79、8.25、58.56、8.13、6.14 μg/mL，即為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 ?精密量取本品1.0 g，置50 mL容量瓶中，甲醇定容，精密稱重，搖勻，超聲處理30 min，放冷，加入甲醇補(bǔ)足損失重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 專屬性考察

陰性對(duì)照溶液制備：按處方量取缺甘草其他各味藥材，按胎樂顆粒的制備工藝制成顆粒，取本品1.0 g，置50 mL容量瓶中，甲醇定容，精密稱重，搖勻，超聲處理30 min，放冷，加入甲醇補(bǔ)足損失重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得甘草陰性對(duì)照品溶液。同法分別制得缺菟絲子陰性對(duì)照溶液、缺黃芩陰性對(duì)照溶液和缺五味子陰性對(duì)照溶液。

分別取陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC分析，色譜圖見圖1，結(jié)果表明陰性樣品對(duì)相關(guān)成分含量測定無干擾，專屬性好。

2.4 線性關(guān)系考察

配制一系列濃度的甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC測定，得到甘草苷的線性方程回歸方程為：Y = 18 300X + 3623.2， r = 0.9999，線性范圍為1.96～19.58 μg/mL;金絲桃苷的線性方程回歸方程為：Y = 23 026X + 3178，r = 0.9998，線性范圍為1.65～16.52 μg/mL;黃芩苷的線性方程回歸方程為：Y = 125 072X + 14629，r = 0.9999，線性范圍為11.71～117.12 μg/mL;黃芩素的線性方程回歸方程為：Y = 87 254X + 1586.7，r = 0.9999，線性范圍為1.63～16.26 μg/mL;五味子醇甲的線性方程回歸方程為：Y = 18 460X + 2144.6，r = 0.9999，線性范圍為1.23～12.28 μg/mL。其中Y為峰面積，單位mAU·s，X為濃度，單位μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下所制備的對(duì)照品溶液，適當(dāng)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下條件分別重復(fù)進(jìn)樣6次，測得甘草苷峰面積RSD = 1.0%，金絲桃苷峰面積RSD = 0.8%，黃芩苷峰面積RSD = 1.1%，黃芩素峰面積RSD = 0.9%，五味子醇甲峰面積RSD = 1.0%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下所制備的供試品溶液（批號(hào)：20180 401），按“2.1”項(xiàng)下條件分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果測得甘草苷峰面積RSD = 1.5%，金絲桃苷峰面積RSD = 1.3%，黃芩苷峰面積RSD = 1.7%，黃芩素峰面積RSD = 1.3 %，五味子醇甲峰面積RSD = 1.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次胎樂顆粒（批號(hào)：20180401），精密稱重，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備6批供試品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC檢測，記錄峰面積，計(jì)算甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲的含量，結(jié)果甘草苷含量RSD = 1.6%，金絲桃苷含量RSD = 1.6%，黃芩苷含量RSD = 1.7%， 黃芩素峰含量RSD = 1.4 %，五味子醇甲含量RSD = 1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的胎樂顆粒（批號(hào)：20180401），每份約0.5 g，并且每一份分別精密加入甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲適量，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，并計(jì)算分析結(jié)果，結(jié)果見表2。結(jié)果甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲的回收率分別為101.75%、102.32%、98.03%、99.52%和100.12%，RSD值分別為0.98%、1.70%、1.35%、1.54%和1.27%，說明本方法加樣回收率較好，可用于含量測定。

2.9 樣品的測定

取3批次胎樂顆粒樣品，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法，參照“2.1”～“2.7”方法測定樣品中甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇甲含量，測定結(jié)果見表3。

3 討論

色譜條件的選擇：本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等洗脫體系，經(jīng)比較，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液分離效果較佳，所以最后選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為洗脫體系，并優(yōu)化得到最佳洗脫程序，甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇保留時(shí)間分別為39.0、43.2、62.8、90.6、113.3 min。

檢測波長的選擇：本研究通過掃描甘草苷、金絲桃苷、黃芩苷、黃芩素和五味子醇在200～400 nm之間的吸收值，同時(shí)對(duì)比供試品的DAD檢測圖譜，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰在254 nm和350 nm處有輕微干擾，270 nm處均有吸收，且分離度佳，最后選擇270 nm處為檢測波長。

先兆流產(chǎn)屬于祖國醫(yī)學(xué)“胎漏”“胎動(dòng)不安”的范疇，是婦科常見病、多發(fā)病之一[16-20]。臨床實(shí)踐表明，胎樂顆粒對(duì)先兆流產(chǎn)有明顯療效[21-22]。本研究采用HPLC法建立胎樂顆粒多指標(biāo)成分的含量測定方法，操作簡單，快速準(zhǔn)確，為該制劑更好地服務(wù)臨床提供保障。

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