通過可調(diào)控Lhx2的表達(dá)制備小鼠造血干細(xì)胞系

杜江龍，曹 欣，薛宇佳，許 強(qiáng)，楊學(xué)才，蔡葵蒸*

(1.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

【研究意義】造血干細(xì)胞可以基于細(xì)胞表面標(biāo)志物而分離獲得，它具有再生和移植于免疫缺陷小鼠后維持功能性血液系統(tǒng)的獨(dú)特能力[1]。造血干細(xì)胞在臨床應(yīng)用方面的重要性以及分離造血干細(xì)胞的能力，導(dǎo)致開發(fā)了多種不同的體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)[2-5]。使用這些不同的培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增造血干細(xì)胞僅取得了有限的成果，因為調(diào)控造血干細(xì)胞自我更新過程的分子和細(xì)胞機(jī)制大部分仍未知[6]。體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的另一條途徑是通過遺傳操作使它們永生化，使用這種方法可建立干細(xì)胞樣細(xì)胞系。這些細(xì)胞系中的大多數(shù)或者在移植后產(chǎn)生功能性血液細(xì)胞的能力有限，或者在這方面遠(yuǎn)未進(jìn)行充分地分析[7-10]。【前人研究進(jìn)展】有報道稱一株造血干細(xì)胞系可以在體內(nèi)產(chǎn)生功能性細(xì)胞，但導(dǎo)致其永生化的遺傳事件卻未知[11]。因此，這個細(xì)胞系的產(chǎn)生難以輕易復(fù)制。有研究者在來源于胚胎干細(xì)胞體外分化的血液祖細(xì)胞中表達(dá)Lhx2基因[12]，獲得了造血干細(xì)胞樣的細(xì)胞系。然而，早期胚胎來源的造血干細(xì)胞，包括那些來源于胚胎干細(xì)胞體外分化的，移植于成體環(huán)境中由于未知的原因效率不高[13]。【本研究切入點(diǎn)】為獲得具有移植于成年受體動物的能力的永生化血液祖細(xì)胞/干細(xì)胞，在來源于成年骨髓的血液祖細(xì)胞/干細(xì)胞中表達(dá)Lhx2基因。這種策略產(chǎn)生了克隆化的并依賴于細(xì)胞因子的干細(xì)胞樣細(xì)胞系[14]。由于造血干細(xì)胞本身并不表達(dá)Lhx2，在造血干細(xì)胞中異位表達(dá)Lhx2可能會改變這些細(xì)胞[15]，降低它們在體內(nèi)的適應(yīng)性。【擬解決的關(guān)鍵問題】為克服這一缺陷，我們擬采用Tet-On誘導(dǎo)型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過添加Doxycycline來誘導(dǎo)Lhx2基因在成年骨髓的血液祖細(xì)胞/干細(xì)胞中表達(dá)，獲得造血干細(xì)胞系[16]；而在這些永生化的造血干細(xì)胞移植前，撤銷Doxycycline，終止Lhx2基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物實驗由西北民族大學(xué)實驗動物倫理委員會審批。10～12周齡的C57BL/6小鼠由中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2 實驗材料

質(zhì)粒來自于美國Addgene；骨髓瘤細(xì)胞來自于ATCC公司(美國)；病毒包裝細(xì)胞系GP+E-86來自ATCC公司(美國)；bone marrow-hematopoietic progenitor cell(BM-HPC) 細(xì)胞系來自于ATCC公司(美國)；BamH I酶和XhoI酶購自NEB公司(美國)； Doxycycline購自 Sigma 公司(美國)； 轉(zhuǎn) 染 試 劑 Lipo-fectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司(美國)；5-氟尿嘧啶按150 mg/kg購自 Sigma 公司(美國)；IMDM培養(yǎng)基液、胎牛血清購自Gibco公司(美國)；0.15 mM的(monothiolglycerol)MTG購自 Sigma 公司(美國)；100 ng/mL 的stem cell factor(SCF)購自 Sigma 公司(美國)；10 ng/mL的anti-IL-6和1 %體積的anti-IL-3、4 μg/mL Polybrene來自Biolegend 公司(美國)； CD3ε購自 Sigma 公司(美國)；B220購自 Sigma 公司(美國)；TER-119購自 Sigma 公司(美國)；anti-CD11b購自 Sigma 公司(美國)；和anti-Gr-1購自 Sigma 公司(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用BamH I/XhoI雙酶切從TtRMPVIR質(zhì)粒上切下dsRed基因片段，并將帶BamH I/XhoI黏性末端的Lhx2 cDNA連接入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體TtRMPVIR質(zhì)粒，成功構(gòu)建的質(zhì)粒命名為VIR-Lhx2；dsRed基因的表達(dá)受四環(huán)素調(diào)節(jié)元件TREtight嚴(yán)格調(diào)控，載體組成型表達(dá)反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下發(fā)生構(gòu)象變化，激活四環(huán)素調(diào)節(jié)元件TREtight，啟動下游基因的表達(dá)；撤銷Doxycycline，則下游基因的表達(dá)終止。

1.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將VIR-Lhx2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系GP+E-86，獲得條件性表達(dá)Lhx2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒；所述細(xì)胞系GP+E-86包含莫羅尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env區(qū)域。

1.3.3 骨髓培養(yǎng) 將10～12周齡的C57BL/6小鼠在獲取骨髓3 d前用5-氟尿嘧啶按150 mg/kg處理，獲取骨髓后在IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中添加10 %胎牛血清，0.15 mM的MTG，100 ng/mL 的SF，10 ng/mL的IL-6和1 %體積的IL-3生成培養(yǎng)基；所述1 %體積的IL-3生成培養(yǎng)基由轉(zhuǎn)染包含小鼠IL-3的載體的骨髓瘤細(xì)胞X63Ag8-653的條件培養(yǎng)基中獲取。

1.3.4 流式分析 用含有4 μg/mL Polybrene的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓細(xì)胞，室溫，轉(zhuǎn)速2000 r/min離心90 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱孵育6 h后，棄去含Polybrene的的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，更換為添加有各種成分的IMDM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，用流式細(xì)胞儀分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+細(xì)胞，Lineage包含CD3ε，B220，TER-119，CD11b，和Gr-1；分選出的細(xì)胞培養(yǎng)于添加有各種成分的IMDM培養(yǎng)基，并添加1 μg/mL的Doxycycline；最后存活的細(xì)胞即為永生化的小鼠造血干細(xì)胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lhx2基因的核苷酸序列

采用Tet-On誘導(dǎo)型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過添加Doxycycline以誘導(dǎo)Lhx2基因在成年骨髓的血液祖細(xì)胞/干細(xì)胞中表達(dá)，獲得造血干細(xì)胞系；Lhx2基因的核苷酸序列如圖1所示。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體TtRMPVIR質(zhì)粒圖譜

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體TtRMPVIR質(zhì)粒的模式圖如圖2所示。dsRed基因的表達(dá)受四環(huán)素調(diào)節(jié)元件TREtight嚴(yán)格調(diào)控。該載體組成型表達(dá)反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下可發(fā)生構(gòu)象變化，激活四環(huán)素調(diào)節(jié)元件TREtight，啟動下游基因的表達(dá)；撤銷Doxycycline，則下游基因的表達(dá)終止。用BamH I/XhoI雙酶切從TtRMPVIR質(zhì)粒上切下dsRed基因片段，并將帶BamH I/XhoI黏性末端的Lhx2cDNA連接入該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，成功構(gòu)建的質(zhì)粒命名為VIR-Lhx2。將VIR-Lhx2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系GP+E-86(該細(xì)胞系包含莫羅尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env區(qū)域)，可獲得條件性表達(dá)Lhx2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

圖1 Lhx2基因的校苷酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of Lhx2 gene

2.3 工藝流程

如圖3所示，將10～12周齡的C57BL/6小鼠在獲取骨髓3 d前用5-氟尿嘧啶(5-FU)按150 mg/kg處理。獲取骨髓后在Iscoves modified Dulbecco medium (IMDM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中添加10 %胎牛血清(FCS)，0.15 mM monothiolglycerol(MTG)，100 ng/mL Steel factor(SF)，10 ng/mL interleukin-6(IL-6)和1 %體積的IL-3生成培養(yǎng)基(由轉(zhuǎn)染包含小鼠IL-3的載體的骨髓瘤細(xì)胞X63Ag8-653的條件培養(yǎng)基中獲取)。用含有4 μg/mL Polybrene的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)上述骨髓細(xì)胞，室溫2000 r/min離心90 min。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱孵育6 h后，棄去含Polybrene的的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，更換為上述添加各種成分的IMDM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h，用流式細(xì)胞儀分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+(LSK)細(xì)胞，Lineage包含CD3ε (145-2C11), B220(RA3-6B2), TER-119, CD11b (M1/70), and Gr-1 (RB6-8C5)。分選出的細(xì)胞培養(yǎng)于上述添加各種成分的IMDM培養(yǎng)基，并添加1μg/mL的Doxycycline。最后存活的細(xì)胞即為永生化的小鼠造血干細(xì)胞。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體TtRMPVIR質(zhì)粒的圖譜Fig.2 Map of retroviral vector TtRMPVIR plasmid

2.4 永生化的造血干細(xì)胞系與原代造血干細(xì)胞對比顯示

將永生化的造血干細(xì)胞系(CD45.2+)與同系物小鼠的原代造血干細(xì)胞(CD45.1+)等比例混合作為供體細(xì)胞，尾靜脈注射于經(jīng)致死輻射處理過的受體小鼠中(CD45.1+CD45.2+)。8周后，檢測骨髓中造血干細(xì)胞的來源，以及脾臟中不同來源的造血干細(xì)胞的分化情況。如圖4所示，永生化的造血干細(xì)胞系和原代造血干細(xì)胞一樣，能在受體小鼠骨髓中增殖，并在外周分化為T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞。

圖3 工藝流程 Fig.3 Flow chart

圖4 永生化的造血干細(xì)胞系在骨髓嵌合小鼠模型中的增殖和分化情況Fig.4 The proliferation and differentiation of immortalized hematopoietic stem cell lines in a bone marrow chimeric mouse model

圖5 永生化的造血干細(xì)胞系與原代造血干細(xì)胞的比較Fig.5 Comparison of immortalized hematopoietic stem cell lines with primary hematopoietic stem cells

如圖5 所示，通過條件性表達(dá)Lhx2獲得的永生化的造血干細(xì)胞系(圖5右側(cè))和成年小鼠骨髓中的原代造血干細(xì)胞(圖5左側(cè))相比，具有相似的表面標(biāo)志物，從而證明Lineage-Sca-1+c-kit+，永生化的造血干細(xì)胞系極易擴(kuò)增，可以獲得大量均一的細(xì)胞群體。

3 結(jié) 論

Lhx2在成人造血祖細(xì)胞/干細(xì)胞中的表達(dá)可再現(xiàn)地產(chǎn)生通過類似物永生化的多潛能造血祖細(xì)胞/干細(xì)胞系。有研究表明BM-HPC細(xì)胞系對干細(xì)胞缺陷的原發(fā)性，繼發(fā)性和三代受者小鼠中的成熟紅細(xì)胞群體也顯示出強(qiáng)烈的貢獻(xiàn)，總共至少18個月的時間，揭示了自我更新和分化的顯著潛力體內(nèi)。當(dāng)紅細(xì)胞完全來源于細(xì)胞系時，受體可以存活，因為在某些情況下，接受移植的干細(xì)胞缺陷動物中100 %的循環(huán)紅細(xì)胞為供體來源。這強(qiáng)烈表明BM-HPC系在體內(nèi)產(chǎn)生功能性紅細(xì)胞。但是與正常HSC相比，BM-HPC系在移植免疫受損小鼠方面效率較低。因為Lhx2很可能不在HSC中表達(dá)，HSC 中Lhx2的異位表達(dá)可能會改變這些細(xì)胞以降低其在體內(nèi)的適應(yīng)性。但是在研究結(jié)果可以看出Lhx2獲得的永生化的造血干細(xì)胞系和成年小鼠骨髓中的原代造血干細(xì)胞相比，具有相似的表面標(biāo)志物，從而證明Lineage-Sca-1+c-kit+，永生化的造血干細(xì)胞系極易擴(kuò)增，可以獲得大量均一的細(xì)胞群體。