裂殼菌L-14原生質體制備與再生體系構建

農 倩，張雯龍，謝 玲，廖仕同，覃麗萍

(廣西農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】裂殼菌(Schizotheciumsp.)作為深色有隔內生真菌(Dark Septate Endophyte, DSE)的一個分類單元[1]，廣泛分布于林地[2]、重金屬礦區[3]、甘蔗種植區[4]、荒漠[5]和沙地[6]等生態環境的植被中，能定殖于多種植物根系中，形成真菌與根系的共生復合體。隨著研究的深入，人們發現極端或特殊生境中的DSE對促進宿主植物生長，提高耐受環境脅迫能力等方面有都發揮著重要作用[7-9]。裂殼菌L-14為本研究組分離自甘蔗根際土壤的一株深色有隔內生真菌，將其接種至甘蔗或香蕉組培苗，能顯著提高植株的株高、鮮重或干重，表現出良好的促生效果[10-11]，且接種后的香蕉植株對香蕉枯萎病的防治效果顯著[11]，顯示出良好的發展應用潛力。對L-14菌株原生質體制備與再生進行研究，對進一步揭示其在植株中的定殖分布規律、闡明其促生和生防作用機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】不同真菌的由于生物學特性差異，原生質體的制備與再生條件也有所不同，常用的細胞壁降解酶有崩潰酶、裂解酶、纖維素酶、蝸牛酶和葡聚糖酶等，酶解溫度多數為26～30 ℃，酶解時間根據菌株特點差異較大[12-13]，另外穩滲劑的選擇也影響原生質體是否易于呈現分散狀態[14]的關鍵因素，一般都需要探索及優化?！颈狙芯壳腥朦c】合適的制備條件有利于提高原生質體的形成率，從而提高轉化效率，目前有關裂殼菌原生質體制備與再生的最適條件尚未明確?！緮M解決的關鍵問題】通過探討不同降解酶液濃度組合、酶解時間、酶解溫度及滲透壓穩定劑種類對裂殼菌原生質體制備的影響，同時篩選適合的原生質體再生培養基，建立高效的裂殼菌原生質體制備和再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

裂殼菌菌株L-14由本研究組分離保存；PDA培養基：新鮮馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、加水至1 L；YEPG培養基[15]：酵母提取物3.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉15.0 g、加水至1 L；PDS培養基：馬鈴薯200.0 g、蔗糖182.0 g、瓊脂8.0 g，加水至1 L；YEPS培養基：酵母提取物3.5 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖200.0 g，瓊脂粉15.0 g，加水至1 L；崩潰酶、裂解酶、蝸牛酶、纖維素酶購自北京索萊寶科技有限公司；STC溶液含1.2 mol/L山梨醇、50 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，使用0.22 μm微孔過濾器過濾除去雜質。其它試劑均為國產分析純。

1.2 菌絲體的制備

取純化培養的L-14菌株，用接種刀剁成細小菌塊接入YEPG培養液中，28 ℃、110 r/min培養7 d后，過濾掉大顆粒菌絲團，收集孢子懸浮液，離心后再次用無菌水懸浮。吸取1 mL懸液至60 mL YEPG培養液中，28 ℃、10 r/min培養，待看到明顯菌絲后，過濾收集菌絲體，并用滅菌的0.7 mol/L NaCl溶液沖洗3次，滅菌濾紙吸干水分。

1.3 原生質體的制備

取上述收集的菌絲體200 mg加入2 mL裂解液中，30 ℃、80 r/min裂解4.0 h，用3層滅菌擦鏡紙過濾，濾液4 ℃、4000 r/min離心10 min，取沉淀加入10 mL STC溶液，4 ℃、4000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用STC溶液調整濃度為1×106個/mL，分裝保存在-80 ℃冰箱待用。

1.4 酶解液種類對原生質體產量的影響

以預冷的滅菌0.7 mol/L NaCl溶液配制不同酶解液組合，常溫70 r/min溶解30 min，經0.22 μm微孔過濾器過濾滅菌(表1)。采用1.3方法進行菌絲裂解，并于裂解開始后，每隔30 min用血球計數板鏡檢計數原生質體，計算產量，每處理重復3次。

1.5 酶解溫度和滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響

采用0.7 mol/L的NaCl為滲透壓穩滲劑，以1.4中獲得的最優酶解液組合分別在25、30、35和40 ℃下，80 r/min酶解5.0 h，計數不同處理原生質體的產量；在最優酶解液組合和酶解溫度下，分別以0.7 mol/L的NaCl、KCl、山梨醇和蔗糖作為滲透壓穩定劑，80 r/min酶解5.0 h后計數不同處理原生質體的產量，每處理3次重復。

1.6 原生質體的再生

取1×104個/mL的原生質體200 μl，分涂布在PDA、YEPG、1和2號再生培養基平板上，28 ℃培養箱中培養7 d，記錄單菌落生長數量。原生質體再生率=(固體培養基上小菌落數量-對照小菌落數量)/原生質體數量×100 %。采用DPS軟件以Duncan’s新復極差法(P≤0.05)進行各處理平均數差異顯著性檢驗。

表1 不同酶解液的組分Table 1 The enzyme combinations

2 結果與分析

2.1 不同酶液組合對原生質體產量的影響

由圖1可知，不同種類的細胞壁降解酶對原生質體產量釋放效果不同，混合酶液(組合3、4)的酶解效率高于單一類酶(組合1、2)。酶解5.0 h后，不同組合降解所得原生質體數量之間均存在顯著差異，其中組合1降解所得的原生質體數量為11.90×105個/mL，顯著高于組合2；組合4原生質體產量顯著高于上述2種單一酶類，組合3原生質體產量最多，達19.73×105個/mL，顯著高于其他組合。

2.2 不同酶解時間對原生質體產量的影響

隨著酶解時間增加，各組合酶液的原生質體產量均呈現先增加后減少趨勢(圖2)，其中組合1、組合2和組合3的最優酶解時間為5.5 h，此時各組合原生質體產量分別為13.07×105、10.73×105和20.87×105個/mL，組合酶液組合4在酶解4.5 h時已達到原生質體最大產量15.77×105個/mL。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level, the same as below圖1 不同降解酶組合對裂殼菌原生質體數量的影響Fig.1 Influences of different enzyme combinations on the protoplast release of Schizothecium sp.

圖2 不同酶解時間對原生質體產量的影響Fig.2 Effects of different enzymatic time on the yield of protoplast

2.3 不同酶解溫度對原生質體產量的影響

以組合3進行酶解時發現，在30 ℃、80 r/min條件下酶解5.0 h獲得的原生質體數量最高，達20.10×105個/mL，與其他溫度處理間差異顯著(圖3)。

2.4 不同滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響

4種滲透壓穩定劑配制的酶液獲得的原生質體產量各不相同(圖4)。通過顯微鏡計數發現，利用無機溶劑(NaCl、KCl)作為滲透壓穩定劑時原生質體較為分散，而有機溶劑(山梨醇、蔗糖)制備的原生質體易聚集成團，其中采用0.7 mol/L的NaCl作為滲透壓穩定劑獲得原生質體數量最多，達到18.43×105個/mL，比其他處理顯著增加。

2.5 不同培養基對原生質體再生率的影響

菌株L-14的原生質體在顯微鏡下呈透明圓球狀，直徑約2～5 μm(圖5A)。將原生質體涂布在PDA、PDS、YEPG和YEPS培養基上，均能生長出菌落(圖5B)，其中YEPG和YEPS培養基上的菌絲顏色稍淺。通過計數菌落數發現，利用PDS培養基的原生質體再生率可達10.65 %，顯著高于其它類型培養基(圖6)。

圖3 不同酶解溫度對原生質體產量的影響Fig.3 Effects of different enzymatic temperature on the yield of protoplast

圖4 滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響Fig.4 Effects of different osmotic stabilizer on the yield of protoplast

圖5 裂殼菌L-14原生質體形態及其再生菌落Fig.5 The protoplast and regeneration colony of Schizothecium sp. L-14

3 討 論

真菌原生質體制備過程包含細胞壁的酶解與原生質體內外滲透壓平衡兩個關鍵環節，而不同真菌細胞壁構成存在差異，在酶液選擇上也各有不同。沈慧敏等[14, 16]研究發現采用崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶組合酶解小麥光腥黑粉菌及小麥矮腥黑粉菌時，獲得的原生質體產量最高，陳亮等[17]采用崩潰酶+裂解酶進行蘋果爛腐病菌原生質體制備也取得良好的效果。本研究通過比較不同的酶液組合對裂殼菌L-14原生質體產量的影響，發現崩潰酶比裂解酶獲得的原生質體數量多，表明崩潰酶對裂殼菌的細胞壁降解作用更顯著；崩潰酶+裂解酶混合進行細胞壁酶解比使用單一酶類效果要好，這可能是不同酶在作用時產生協同效應，提高了細胞壁的降解效率；崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶組合降解細胞壁時，原生質體產量低于崩潰酶+裂解酶組合，猜測酶成分過高時會對原生質膜產生一定損傷，導致原生質體的破碎解離，表明并非酶成分越豐富酶解效果越顯著。

研究發現，制備真菌原生質體時，隨著酶解時間增加，原生質體數量會呈現先增加后減少的趨勢[16-17]，本試驗結果與前人研究基本一致。原生質體達到最大產量后下降的原因可能是酶液隨著作用時間變長而活力降低，新釋放的原生質體數量少于自身破碎解離的量所導致。另外，本研究中崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶組合在酶解4.5 h后達到原生質體最大產量，時間比最佳酶組合(崩潰酶+裂解酶)快1.0 h，但隨后原生質體數量急劇減少，酶解7.0 h后，原生質體僅有7.43×105個/mL，數量顯著低于最佳酶組合，表明該酶組合可能對原生質膜存在一定破壞作用，不利于原生質體的保存。

滲透壓穩定劑是原生質體維持膜內外壓力平衡、保持活力的重要介質，本研究發現利用無機溶劑作為滲透壓穩定劑時原生質體較為分散，而有機溶劑制備的原生質體易聚集成團，與沈慧敏等[14, 16]的研究結果一致。另外也有報道采用無機溶劑與有機溶劑相混合作為穩滲劑，并獲得高質量原生質體[18]，上述方法是否適用于裂殼菌原生質體的制備保存有待進一步的驗證。已報道的用于真菌原生質體再生的培養基配方種類較多，本研究發現PDS配方較利于裂殼菌原生質體的再生，獲得的再生率顯著高于其它類型培養基，前人的研究發現該配方亦適用于蘋果爛腐病菌[17]及木霉[19]等真菌的原生質體再生。

圖6 不同培養基上的原生質體再生率Fig.6 The regeneration rate of protoplast in different medium

4 結 論

初步構建了裂殼菌L-14原生質體制備和再生體系：菌株經YEPG液體培養基培養7 d后，使用0.7 mol/L的NaCl作為滲透壓穩定劑配置濃度各為20 mg/mL的崩潰酶+裂解酶復合酶液，在30 ℃、80 r/min酶解5.5 h后可獲得較好的原生質體數量，使用PDS培養基較利于裂殼菌原生質體的再生。