不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量研究

楊 雁，石 瑤，田 浩，楊天梅，左智天，袁理春，金 航

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】滇龍膽(Gentianarigescens)又稱滇龍膽草、堅龍膽，屬于龍膽科( Gentianaceae ) 龍膽屬(GentianaLinn.)多年生草本植物，主要分布于四川、貴州、湖南、云南等地，是中國重要的資源植物[1]，云南是其主要的產(chǎn)區(qū)。滇龍膽被歷版《中國藥典》收錄，為傳統(tǒng)中藥龍膽的基源植物，在云南有著悠久的藥用歷史，其具有瀉肝膽火和除下焦?jié)駸岬裙π2]。近年來研究表明滇龍膽含有裂環(huán)烯醚萜、環(huán)烯醚萜、龍膽苯甲酸酯等多類成分，其中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷具保肝、護肝活性[3]，是滇龍膽主要的有效成分。【前人研究進展】隨著藥廠對滇龍膽的需求量日益增加，有限的野生滇龍膽資源已滿足不了現(xiàn)代市場對滇龍膽藥材的需求，經(jīng)過多年的試驗研究，目前，滇龍膽已經(jīng)實現(xiàn)了人工規(guī)模化種植，在云南省臨滄云縣、永德等地是其主要道地產(chǎn)區(qū)[4]。關(guān)于林藥復(fù)合種植的研究目前主要集中在其生態(tài)效益和經(jīng)濟效益[5-7]，課題成員對林藥復(fù)合種植模式下藥用植物有效成分含量變化也開展了很多的研究工作，但選擇的復(fù)合種植模式比較單一，種類比較少[8-10]。【本研究切入點】本研究選取7種常見的滇龍膽林藥復(fù)合種植模式作為研究對象，采用超聲波提取法，利用高效液相色譜測定7種林藥復(fù)合栽培模式下滇龍膽植株中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、和當(dāng)藥苷4種有效成分含量，依據(jù)測定結(jié)果對不同種植模式滇龍膽有效成分進行方差分析和相關(guān)性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對不同林藥復(fù)合栽培模式下滇龍膽植株中有效成分的測定，探討不同種植模式滇龍膽中有效成分的積累特征，以期為滇龍膽林藥復(fù)合種植適應(yīng)性及栽培管理提供理論依據(jù)。

表1 不同林藥復(fù)合種植模式下滇龍膽生境條件Table 1 Habitat conditions of Gentiana rigescens under different intercropping patterns

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品于2016年11月采集自云南省臨滄市云縣，采樣區(qū)域生長海拔相近，選取7種滇龍膽復(fù)合種植模式：包括滇龍膽與木果石櫟、尼泊爾榿木、核桃樹、桉樹、杉木、木瓜和茶樹復(fù)合種植。依照5點采樣法采樣，每種復(fù)合種植模式的樣地面積為48 m2，分別采集滇龍膽60株，種植時間均為3年。每種種植模式隨機選取10株滇龍膽樣品，去除泥土，取根莖部位，將樣品置于100 ℃的烘箱殺青后置于70 ℃條件下烘干至恒重，粉碎，過60目篩，避光保存?zhèn)溆谩２煌炙帍?fù)合種植模式下滇龍膽生境條件見表1。

1.2 方法

實驗儀器：LC-10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)：SPD-M10Avp二級管陣列檢測器， 7725i手動進樣器；萬分之一電子分析天平(美國奧豪斯)；FW-100型高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)； VE-A超純水機(深圳宏森環(huán)保科技有限公司)；FRQ-型超聲波清洗儀(杭州法蘭特超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

實驗試劑：對照品購自中國食品藥品檢定研究院(龍膽苦苷110730-201315，馬錢苷酸111765-201402，獐牙菜苦苷110765-201303，當(dāng)藥苷114742-201131)；乙腈為色譜純；水為超純水；甲酸為分析純。

1.3 色譜條件

島津Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.1 %甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～5 min，5 % B；5～10 min，5 %～10 % B；10～26 min，10 %～26 % B；26～30 min，26 %～35 % B)，流速1.00 mL/min，檢測波長241 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μl。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液制備 精密稱取龍膽苦苷38.0 mg、馬錢苷酸10.0 mg，獐牙菜苦苷8.0 mg，當(dāng)藥苷7.5 mg對照品溶液，分別用甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得到對照品儲備溶液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取各對照品儲備液1 mL，于10 mL容量瓶中混合均勻，用甲醇定容至刻度，得混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩０?.3 色譜條件進樣，得色譜圖(圖1)。

1：馬錢苷酸；2：獐牙菜苦苷；3：龍膽苦苷；4：當(dāng)藥苷1: Loganic acid; 2: Swertiamarin; 3: Gentiopicroside; 4: Sweroside圖1 混合對照品圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard samples

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱取0.2 g樣品粉末于10 mL具塞試管中，加入10.00 mL 35 %乙醇溶液，超聲提取50 min，待溶液冷卻至室溫后稱重，甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微膜過濾，取濾液得供試樣品溶液。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別吸取10 μl進樣。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，見表2。

1.5.2 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液各10 μl，在1.3色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算峰面積，RSD值分別為龍膽苦苷0.85 %、馬錢苷酸0.92 %、獐牙菜苦苷1.08 %、當(dāng)藥苷1.29 %，表明儀器精密度良好。

1.5.3 重復(fù)性實驗 精密稱取各6份，依照1.4.2的方法制備供試品溶液，在1.3色譜條件下進行測定，計算峰面積RSD值分別為1.12 %、2.05 %、1.85 %和2.24 %，表明供試品溶液重復(fù)性良好。

1.5.4 穩(wěn)定性實驗 精密稱取同一滇龍膽樣品0.2 g，依照1.4.2的方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 內(nèi)記錄峰面積，計算RSD值分別為0.73 %、1.05 %、1.21 %和1.93 %，表明在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.5.5 回收率實驗 精密稱取0.2 g已知含量的滇龍膽樣品(3次重復(fù))，分別按高(120 %)中(100 %)低(80 %)濃度加入4種對照品，依照1.4.2的方法制備供試品溶液，在1.3色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果顯示4種有效成分的平均回收率分別為100.41 %、96.03 %、96.5 %和97.9 %，表明此方法準(zhǔn)確度較高(表3)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和DPS 7.05統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 七種林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量及方差分析

由表4可知，滇龍膽中馬錢苷酸的含量在滇龍膽-核桃復(fù)合種植模式下最高(9.74 mg/g)，在滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式下最低(5.78 mg/g)，滇龍膽-核桃復(fù)合種植模式下馬錢苷酸的含量顯著高于其它6種復(fù)合種植模式。滇龍膽中獐牙菜苦苷的含量在滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式下的含量最高(10.82 mg/g)，在滇龍膽-茶樹復(fù)合種植模式下的含量最低(8.25 mg/g)，滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式下獐牙菜苦苷的含量顯著高于滇龍膽-茶樹、滇龍膽-尼泊爾榿木、滇龍膽-木瓜復(fù)合種植模式，其余種植模式差異不顯著。滇龍膽中龍膽苦苷的含量在滇龍膽-尼泊爾榿木復(fù)合種植模式下最高(85.99 mg/g)，在滇龍膽-杉木復(fù)合種植模式下最低(49.55 mg/g)，滇龍膽-尼泊爾榿木復(fù)合種植模式下龍膽苦苷含量除與滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式差異不顯著外，與其它5種復(fù)合種植模式龍膽苦苷含量差異顯著。滇龍膽中當(dāng)藥苷的含量在滇龍膽-杉木復(fù)合種植模式下的含量最高(2.05 mg/g)，在滇龍膽-木瓜復(fù)合種植模式下的含量最低(1.5 mg/g)，7種復(fù)合種植模式當(dāng)藥苷的含量差異均不顯著。

表2 回歸方程與線性范圍Table 2 Linear relations and linear ranges

表3 回收率實驗Table 3 Recovery experiment

方差分析結(jié)果表明：不同林藥種植模式對滇龍膽根莖中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐芽菜苦苷含量有顯著影響。

2.2 不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分的相關(guān)性分析

不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分的相關(guān)性分析(表5)結(jié)果顯示，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量呈極顯著正相關(guān)(R=0.35，P< 0.01)，當(dāng)藥苷分別與馬錢苷酸和獐牙菜苦苷含量呈極顯著正相關(guān)(R=0.49，P< 0.01；R=0.41，P< 0.01)。

表4 不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量的比較Table 4 Comparison of effective components of Gentiana rigescens from different intercropping patterns

注：同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note: Different lowercase in same column indicates significant difference (P<0.05).

表5 不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of effective components of Gentiana rigescens from different intercropping patterns

注：**表示在P< 0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。
Note: ** means significant correlation atP< 0.01 level.

3 討 論

光是影響植物次生代謝產(chǎn)物形成的重要環(huán)境因素[11]，研究表明藥用植物藥效成分的產(chǎn)生和積累受生態(tài)環(huán)境因素的影響，光照、水肥條件等對藥用植物的有效成分也有影響[12～13]。研究發(fā)現(xiàn)不同光照條件下三花龍膽(GentianatrifloraPall.) 中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的含量有顯著變化，因此不同顏色和波長范圍的光照可影響植株體內(nèi)化學(xué)成分的變化[14]。在7種林藥復(fù)合種植模式，尼泊爾榿木和木果石櫟均為高大喬木，株高可達(dá)15～30 m，林冠稀疏，因此在尼泊爾榿木和木果石櫟復(fù)合種植下的滇龍膽生境條件光照十分充足，滇龍膽植株生長較好；與茶樹套種，茶樹比較低矮，株高低于1.5 m，種植區(qū)域均為臺地茶，行間距在1 m左右，生境條件光照不充足，不利于滇龍膽生長；核桃樹、木瓜株高有3～5 m，但這兩種樹種枝葉比較稠密，套種在這兩種模式林下光照條件較差；桉樹為高大喬木，根系發(fā)達(dá)，蒸騰作用比較強，對土壤水分需求量較高，對土壤養(yǎng)分需求量巨大，不利于其他植物生長，因此滇龍膽-桉樹復(fù)合種植條件下，滇龍膽植株生長情況也不是太好；杉木為高大喬木，對滇龍膽生境條件光照影響較小，但杉木對土壤水分和養(yǎng)分需求量較高，根系比較淺，側(cè)根、須根發(fā)達(dá)，與滇龍膽根系生長的耕層土壤在同一區(qū)域，也不利于滇龍膽根系的生長。

這7種復(fù)合種植模式下滇龍膽有效成分測定結(jié)果顯示，滇龍膽與尼泊爾榿木復(fù)合種植植株有效成分總含量最高，與木果石櫟復(fù)合種植滇龍膽植株有效成分總含量次之，與杉木復(fù)合種植有效成分總含量最低。有研究顯示不同的栽培模式改變了植物生長的環(huán)境，對植物生長產(chǎn)生特定的刺激，最終造成其質(zhì)量的差別[15]；在光照強度較高的生境中藥材有效成分含量高于光照強度較低的生境[16]；適宜的間作復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)可以改善生態(tài)環(huán)境小氣候。

4 結(jié) 論

通過對7種不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量進行分析，滇龍膽所處的生境不同，所接受的光照、溫度、水分等也不同，加之植物之間的化感作用，滇龍膽有效成分含量差異顯著，滇龍膽不同林藥復(fù)合種植模式下有效成分含量變化可能與其生長的微環(huán)境有關(guān)，還需從植物學(xué)、植物生理學(xué)、栽培學(xué)等方面進行深入研究，為提高滇龍膽藥材品質(zhì)及復(fù)合生態(tài)種植技術(shù)提供指導(dǎo)性數(shù)據(jù)。