基于KASP技術的稻瘟病抗性基因Pi9分子標記的開發與評價

韋 宇，李孝瓊，何新柳，陳紅操，陳 穎，黃克寧，盧東長城，郭嗣斌*

(1. 廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室，廣西 南寧 530007；2. 南寧維尓凱生物科技有限公司，廣西 南寧 530033；3. 廣西壯族自治區農業科學院，廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界近50 %的人口以稻米為主食[1]。然而，由絲狀子囊真菌稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的水稻稻瘟病是全球范圍內嚴重影響稻米品質及產量的主要病害之一，給糧食生產帶來重大損失，嚴重威脅世界糧食安全[2-3]。目前，稻瘟病的防治措施主要有噴施化學藥劑和選用抗稻瘟病品種，但是使用化學藥劑進行防治存在危害環境、增加農業成本等問題。水稻生產實踐證明，防治稻瘟病最經濟有效的手段就是培育和種植抗稻瘟病水稻品種，而其中的關鍵則在于廣譜高抗的抗性基因資源的鑒定及發掘。【前人研究進展】隨著水稻稻瘟病基因研究的不斷深入，很多與稻瘟病抗性基因相關的分子標記相繼被開發出來。截至2017年，水稻中被報道的主效稻瘟病抗性基因超過100個[4]，其中已有27個稻瘟病抗性基因被成功克隆，如Pib[5]、Pb1[6]、Pita[7]、Pi9[8]、Pi2[9]、Pid2[10]、Pi36[11]、Pi37[12]、Pi56[13]及Pigm[14]等。學者們針對已克隆的抗稻瘟病基因開發出了特異性分子標記，利用這些分子標記不僅可以快速準確地對水稻資源進行鑒定，挖掘抗稻瘟病的種質資源，還可以進行分子標記輔助育種，培育抗稻瘟病的育種新材料[15]。Pi9基因來源于小粒野生稻(Oryzaminuta)，具有廣譜抗性，對來自全世界各稻區的43份稻瘟病菌株都表現出較高的抗性[16-17]。目前在Pi9基因的分子標記輔助育種上，普遍使用PB8標記進行，但該標記為顯性標記，不能鑒別稻株的基因型是雜合型還是純合型，只適合在育種早期進行選擇[18]。另外，殷得所等[19]通過將含Pi9基因的“WHD75-1-127”株系與不含該基因的“揚稻6號”以及“Nipponbare”中的Pi9基因進行比較，根據序列差異設計了一個共顯性InDel標記，為PB9-1標記，但實驗過程中發現抗病材料和感病材料之間只相差3 bp，必須用聚丙烯酰胺凝膠電泳才能檢測出來，對實驗條件的要求較高，而且最后也難以區分純合體和雜合體。KASP(Kompetitive allele specific PCR)是競爭性等位基因特異性PCR，是一種基于SNP的新型基因分型技術。KASP 技術具有穩定性好和準確性高、高通量，以及無需合成特異熒光探針，檢測成本較低等優點，近年來得到快速的發展，目前已廣泛應用于SNP高通量分型、InDels檢測等領域[20-21]，目前在水稻[22]、小麥[23-25]、卷心菜[26]以及大豆[27-29]等作物中得到廣泛的應用。【本研究切入點】利用KASP技術開發Pi9基因熒光分子標記，經簡單的PCR擴增和熒光掃描就能快速獲得基因分型結果，不需要經過繁瑣的凝膠電泳分析，從而顯著提高檢測效率。因此，該標記可以作為一種高通量的基因分型分子標記。【擬解決的關鍵問題】針對不同水稻材料中Pi9基因差異序列設計、開發可用于篩選具有廣譜抗稻瘟病基因Pi9的KASP分子標記，通過分析比對水稻后代群體278份子代材料Pi9基因的Pi9-KASP基因型和SSR標記基因型，并結合子代材料的稻瘟病抗性鑒定結果，驗證該KASP標記有效性。擬解決普通分子標記過程中費時費力的問題，加速分子標記輔助聚合優異抗病基因及培育抗病新品種的進程。

表1 供試材料Table 1 Tested material

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括供體親本“1205”，受體材料“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”，以及供體親本分別與受體親本雜交、回交后衍生的5個后代群體71、72、79、80、81(表1)。供體材料“1205”是廣西農業科學院水稻所選育的攜帶廣譜稻瘟病抗性基因Pi9，且經過田間抗性調查明確具有抗稻瘟病的品系。受體親本“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”是由廣西農業科學院水稻研究所選育的，且經田間抗性調查明確不抗稻瘟病的品系。

1.2 水稻葉片DNA提取

于2018年11月18日采集水稻幼苗期葉片，利用CTAB法快速提取基因組總DNA，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。采用Thermo Fisher的Nanodrop 2000 分光光度計進行DNA 濃度測定，將DNA 濃度調整到50 ng/μl。

Pi9-KASP分子標記引物的設計，其中重點突出部分為Pi9在各個株系中的SNP位點Primer design of Pi9-KASP molecular marker, the highlight of which is the SNP site of Pi9 in each strain圖1 Pi9基因中用于開發標記的SNP位點及其引物設計Fig.1 SNP locus for the development of markers in the Pi9 gene and its primer design

表2 標記引物序列Table 2 Sequence information of marker primers

1.3 KASP分子標記的開發與利用

通過PCR克隆并測序分析，比對供體親本與受體親本之間的Pi9基因序列，獲得Pi9基因編碼區特異性SNP突變位點(圖1)，根據互補鏈SNP位點前后各60 bp的堿基序列設計了KASP分子標記引物Pi9-KASP，包括1條正向通用引物和2條反向特異性引物(表2)。2條反向引物分別對應FAM 和HEX 2 種熒光信號，FAM標簽序列為GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，HEX標簽序列為GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。Pi9-KASP 引物的設計和合成由LGC公司完成。

將提取的DNA稀釋5 ng/μl，分別加入96孔板中，配制反應體系進行PCR擴增反應。每個孔的PCR反應體系總體積為10.14 μl，包括2×KASP Master mix 5 μl，KASP Primer mix 0.14 μl，模板DNA 5 μl。在ABI 7500 real-time PCR system上的PCR反應程序為：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s；61～55 ℃退火延伸60 s，10個循環(每個循環降低0.6 ℃)；94 ℃變性20 s；55 ℃退火延伸60 s，26個循環。反應結束后，根據檢測的2種熒光信號來判斷樣本分型情況，根據不同的熒光信號獲得不同的基因型(表3)。根據序列比較結果分析，預測PCR反應后，Pi9基因擴增一定可以檢測到FAM熒光信號，其他無Pi9基因的子代材料的等位基因擴增可以檢測到HEX熒光信號，從而將Pi9在抗性品種的基因型與感病品種的基因型區分開。

1.4 SSR分析

PCR 反應總體積為15 μl，其中DNA 模板2 μl，2×TaqPCR Master Mix 6 μl，10 nmol/L的正反向引物各0.5 μl，加ddH2O補足15 μl。稻瘟病抗性基因Pi9的特異性標記M-Pi9的引物序列為：5’-GCTGTGCTCCAAATGAGGAT-3’， 5’-GCGATCTCACATC CTTTGCT-3’。

M-Pi9的PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min 后進行35個循環擴增，循環條件為94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，循環結束后再72 ℃延伸5 min，反應結束后體系于4 ℃保存，M-Pi9的PCR擴增產物中加入核酸染料，用濃度為2 %的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，于凝膠成像系統中拍照并記錄結果。陽性純合結果記為“+”，陰性純合結果記為“-”，雜合記為“3”。

表3 等位基因及其對應熒光標記Table 3 Corresponding relation of alleles and fluorescence marker

1.5 稻瘟病自然誘發抗性鑒定

自然誘發病圃設在稻瘟病多發區岑溪梨木鎮高圍村，面積約為0.7 hm2。病圃常年處于高溫、高濕的氣候環境中，具有利于發病的地理環境條件，歷年稻瘟病發生嚴重。病圃全生育期不噴殺菌劑，殺蟲劑的使用量根據病圃蟲害發生的程度而定。于2018年7月20日將5個分離群體種植于病圃，以桂井1號為感病對照。在成熟期，以桂井1號充分發病為準，對供試材料進行穗頸瘟調查。每個群體至少調查100株。田間的栽培管理、調查方法、病級劃分、記載標準和抗性評價按顏群等[30]的水稻品種試驗抗性鑒定方法與標準執行。抗性類型：抗(抗性指數≤2.0)，中抗(2.1～4)，中感(4.1～6)，感(6.1～7.5)，高感(7.6～9)。

2 結果與分析

2.1 利用 Pi9-KASP分子標記對子代群體Pi9基因進行檢測

利用設計的Pi9-KASP標記對雜交群體中278個單株進行基因分型，結果發現141個單株的基因型為T/T，137個單株的基因型為C/C(圖2，表4)。

2.2 利用SSR標記對子代群體Pi9基因進行檢測

以受體材料58的回交改良過程為例。在雜交后代選擇含Pi9抗性基因、農藝性狀優良的單株進行回交，利用Pi9基因內的SSR標記M-Pi9對雜交子代群體進行檢測。在BC1F1群體中，共檢測了20個單株，其中有9個單株含Pi9雜合基因，部分檢測結果見圖2，其中1、2、3、4、5為含目標基因的雜合體。分子標記輔助篩選含Pi9抗性基因單株，經過回交2次，自交2次，獲得BC2F3。2018年晚季大區種植BC2F4，在BC2F4群體中檢測子代群體的SSR標記基因型，與Pi9-KASP分子標記的檢測結果比對，結果顯示Pi9-KASP分子標記分型結果與SSR分子標記檢測結果一致(表4)。

利用Pi9-KASP對供體親本“1205”，受體親本“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”，以及其雜交衍生群體Pi9等位基因的分型；圖中每個圓點對應一個樣品；藍點表示該樣品基因型為C/C，具有HEX標簽序列；紅點表示該樣品基因型為T/T，具有FAM標簽序列；×為空白對照(NTC)以及未檢出的樣品。以供體親本“1205”、受體親本(“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”)，以及供體親本和受體親本的混合DNA作為陽性對照Genotyping of the donor parent ‘1205’, receptor parents ‘58’, ‘91’, ‘1208’, ‘1209’, ‘1298’ and their hybrid progeny population by Pi9-KASP; Each dot in the figure corresponds to a sample; The blue dot indicates that the sample genotype is C/C and has a HEX tag sequence; The red dot indicates that the sample genotype is T/T, and has a FAM tag sequence; ×represents NTC (Non-Template-control) and undetected samples. The DNA of the donor parent ‘1205’, the receptor parents (‘58’, ‘91’, ‘1208’, ‘1209’, ‘1298’), and the mixed DNA of the donor parent and the receptor parents were used as positive controls圖2 利用Pi9-KASP分子標記對5個親本及衍生群體278個單株的基因分型檢測結果Fig.2 Genotyping result of 5 rice germplasm and 278 individual plants of the derived population by using Pi9-KASP

表4 部分材料稻瘟病抗性及KASP分型、SSR標記檢測結果Table 4 Resistance of some materials against blast resistant and test results with KASP typing and SSR molecular markers

續表4 Continued table 4

編號NumberKASP分型KASPtypingSSR抗性Diseaseresistance編號NumberKASP分型KASPtypingSSR抗性Diseaseresistance71-3-2T/T+R79-2-4T/T+MR71-3-3T/T+R79-2-5T/T+R71-3-4T/T+R79-2-6T/T+R71-3-5T/T+R79-2-7T/T+R71-3-6T/T+R79-2-8T/T+MR71-3-7T/T+R79-2-9T/T+R71-3-8T/T+R79-3-1T/T+R72-1-1C/C-S79-3-2T/T+MR72-1-2C/C-S79-3-3T/T+R72-1-3C/C-HS79-3-4T/T+MR72-1-4C/C-HS79-3-5T/T+R72-1-5C/C-S79-3-6T/T+R72-1-7C/C-S79-3-7T/T+MR72-1-8C/C-HS79-3-8T/T+R72-1-9C/C-S79-3-9T/T+R72-2-1C/C-S79-3-10T/T+R

2.3 子代群體對稻瘟病的抗性表現

在岑溪稻瘟病鑒定點，2018年晚季感病對照桂井1號的穗瘟發病率均達100 %，病級達到7～9級，說明病圃發病條件充足，鑒定結果較可靠。對5個分離群體穗頸瘟的調查結果表明，含有Pi9基因的株系抗性基本都表現為抗(R)～中抗(MR)以上，抗級1～4級，平均為2.9級；不含Pi9基因的株系抗性均表現為感(S)～高感(HS)，抗級為6～9級，平均抗級為7.9，抗性鑒定結果與Pi9-KASP分子標記分型結果及SSR分子標記檢測結果比較一致(表4)。

3 討 論

長期以來育種家們主要利用雜交、回交等常規育種技術結合人工接種或者自然感病的方式篩選新的抗性品種。然而，傳統方法的鑒定結果往往受到環境或人為因素的影響，而且稻瘟病菌的生理小種極易發生變異，導致了抗稻瘟病品種選育的難度大大增加，降低了抗病品種選育效率。利用分子標記輔助選擇技術可以在群體的早世代時進行稻瘟病抗性基因的檢測，提高育種效率及可靠性，加快育種進程。前人研究結果表明，當分子標記與目的基因的遺傳距離小于5 cM時，選擇到含有目的基因的準確率可達99.75 %[31]。Pi9基因已成功被部分育種研究者用于改良雜交水稻的稻瘟病抗性，如聶元元等[32]

M：分子量標準；P1：供體親本1205；P2：受體親本58；1～10：BC1F1單株M: DNA Marker；P1:Donor parent 1205； P2: Receptor parent 58；1-10: BC1F1 population圖3 引物M-Pi9對子代群體的單株篩選Fig.3 Screening of BC1F1 by primer M-Pi9

利用分子標記輔助選擇方法，將抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi9成功導入到三系雜交稻恢復系“R225”中，其中含有1個或2個抗性基因的目標株系的稻瘟病抗性均達到中抗水平以上；孫永建等[32]利用含Pi9基因的“C2”供體親本，通過常規育種及分子輔助選擇手段，獲得13個農藝性狀優良且抗性較好的改良新抗稻瘟病材料。

普通的Pi9分子標記主要依賴于瓊脂糖電泳或PAGE 膠電泳分析，試驗費時費力，而本研究利用KASP方法建立的Pi9熒光分子標記不需要進行電泳分析，3個96 孔板即可完成對本研究278份樣品的檢測，省時省力。本研究結果表明，該KASP標記能快速準確地檢測出水稻中Pi9基因對應的熒光標記，基因分型結果與SSR分子標記檢測結果一致，基因型與抗性表型也比較一致，可放心用于分子標記輔助選擇育種中。鑒于KASP標記檢測技術具有穩定性好、準確性高、檢測成本較低和高通量等優點，借助KASP標記，可以對大批量的樣品進行精準的雙等位基因分型，達到高通量進行目標基因驗證和檢測的效果。

本研究中，利用KASP標記和SSR標記兩種方法對72群體的單株進行檢測，發現所有單株均不含有Pi9基因，其抗性也表現為感或高感，這可能是由于該群體在之前選育過程中沒有用分子標記跟蹤抗性基因而導致其丟失。因此，在選育過程中，在材料群體的早世代特別是分離世代，利用分子標記跟蹤目標基因，可以避免盲目性，提高育種效率及可靠性。

另外，在本研究中，含有Pi9基因的株系抗性基本都表現為抗(R)-中抗(MR)以上，不含Pi9基因的株系抗性均表現為感(S)或高感(HS)，這表明利用Pi9基因改造水稻稻瘟病抗性效果比較好。但由于自然界稻瘟病菌生理小種極易發生變異，導致水稻在不同環境下抗性不穩定，因此，通過分子標記方法將多個抗稻瘟病基因聚合到同一水稻品種中，是培育廣譜、持久抗稻瘟病品種的有效途徑。

4 結 論

KASP 標記檢測技術能夠快速、可靠地對水稻中抗稻瘟病基因Pi9進行基因分型檢測，分型效率高。本研究開發的Pi9-KASP 標記為利用Pi9基因進行高效、可靠的分子標記輔助選擇育種打下了堅實的基礎。