一種快速高效提取花生葉片DNA的簡化方法

劉 宇，李春娟，閆彩霞，趙小波，孔 青，孫全喜，苑翠玲，王 娟*，單世華*

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000； 2. 山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生(ArachishypogaeaL.)隸屬豆科(Leguminosaesp.)蝶形花亞科(Papilionoideae)花生屬(Arachis)，是世界上最重要的油料作物之一[1]。同時，花生種子富含優質蛋白質，也是維生素和礦物質的良好來源[2]。大量研究者期望通過分子改良育種的方式獲得高蛋白、高油酸和高抗性的花生品種。分子標記與輔助選擇技術以基因組測序為重要參考(https://peanutbase.org/)，該技術可大大縮短育種周期，提高花生的育種效率[3]。而獲得高質量的基因組DNA是相關研究開展的第一步，但是花生組織材料中的蛋白質、多糖、多酚物質以及其他次生代謝產物等給DNA的提取和純化造成很大的阻礙。此外，下一代測序技術(Next Generation Sequencing, NGS)對DNA的質量有了更高的要求，傳統的DNA提取方法SDS法與CTAB法提取花生葉片基因組DNA的濃度和純度尚不能滿足目前高通量測序的要求。另外，植物DNA提取試劑盒價格較高且普通存在提取總量較低的狀況。因此，本研究旨在CTAB法基礎上優化出一套成本低，耗時短的簡化方法，并且能夠適用于高通量測序的高質量DNA，為花生分子育種與篩選的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究隨機選用4個花生品種(表1)。每個品種選取2～4粒完整飽滿種子，于培養皿中避光浸種3～4 d，待芽長至2～4 cm后置入培養盒，光照培養箱(溫度：25 ℃；光照強度：12000 lx)培養10～13 d。實驗時取第三對真葉。

表1 四份DNA提取花生品種信息

1.2 DNA提取

1.2.1 快速提取花生葉片DNA改良步驟如下：

(1) 稱取50 mg花生幼嫩葉片，置于1.5 mL離心管中，將離心管中下部浸入液氮，取出離心管后用已燒制成球狀且預冷的200 μL槍頭(液氮中浸泡4～5 s)快速研磨。

(2) 加入650μL預熱的CTAB，加入RNase A酶6.5μL，渦旋振蕩30s，顛倒混勻后，迅速放入65℃水浴鍋中孵育30min。每10min顛倒混勻一次。

(3) 從水浴鍋中取出樣品管，加入650 μL預冷的酚-氯仿(25∶24)，蓋好管蓋后緩慢上下顛倒搖動5～10 min。10000 r/min下離心10 min。重復本步驟一次。

(4) 用移液槍緩慢吸取上層清液650～700 μL至1.5 mL離心管中。

(5) 在獲得的上清液中沿管壁緩慢加入預冷的異丙醇500 μL，可觀察到接觸面有沉淀層產生。

(6) 快速吸去上層與下層液體，將中間沉淀層轉移至新的離心管當中。

(7) 加入600 μL 70%乙醇600 μL洗滌沉淀，振蕩數秒鐘，5000 r/min條件下離心1 min去上清液。重復本步驟一次。

(8) 室溫下干燥DNA沉淀，當有無色膠狀物附在管壁時，加入70 μL TE緩沖溶液(Tris-EDTA buffer solution)溶解沉淀的DNA。

1.2.2 CTAB法花生葉片DNA提取步驟

用常規CTAB法[4]提取DNA。

1.3 DNA檢測方法

1.3.1 總DNA電泳檢測

以DL 15000 DNA Marker(TaKaRa, Dalian)為標記， 取DNA溶液2 μL與適量6×Loading Buffer(TaKaRa, Dalian)混勻，點入含有Super GelRed(US EVERBRIGHT, Suzhou)的1% DNA瓊脂糖(US EVERBRIGHT, Suzhou)凝膠中，1×TAE緩沖液電泳，于凝膠成像分析系統(Tanon 2500R, Shanghai)獲取圖像。

1.3.2 DNA濃度和純度檢測

取1 μL DNA提取液于Nanodrop-超微量分光光度計(Pultton P100/P100+，Shanghai)樣品室中，檢測其相對濃度以及根據OD260/OD280、OD260/OD230值確定DNA的純度，每個樣品檢測三次，求平均值。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法DNA提取時間比較

使用花生葉片DNA簡化提取法完成四個花生葉片的 DNA 提取共用時約1h 15min，而使用CTAB 法完成相同規模DNA 提取則需要 3 h左右，時間縮短一半以上。

2.2 不同提取方法對DNA完整性的影響

從CTAB 法提取的花生葉片總 DNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳圖(圖1 A)可見，該法提取的花生葉片DNA的條帶都有拖尾，帶型不整齊，說明DNA已有部分降解，DNA完整性較差；此外，點樣孔中有白亮物質，說明樣品DNA中殘留有少量的多糖、蛋白質或其他雜質[5]。

圖1 花生葉片總DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from peanut leaves 注： A:CTAB法 CTAB method; B:提取簡化法 Simplified method

表2 兩種方法提取花生葉片的總DNA 質量比較

注： 表中濃度及純度值均為三個重復樣品的平均值。

Note: All DNA concentration and purity data is the average value from three repeats

從DNA簡化法提取的花生葉片總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖 (圖 1 B)可見，花生葉片DNA的條帶清晰單一，帶型整齊，點樣孔中未發現有白亮物質，說明獲得的DNA完整性好、未發生降解。由此可見，經過DNA簡化方法提取的DNA完整性顯著提高，且未發現殘留的酚類物質、蛋白質或其他雜質，DNA提取效果顯著增加。

2.3 不同提取方法對DNA純度與產量的影響

OD260與OD280的比值通常用于DNA純度的判定。OD260/OD280>2.0表示有RNA污染，OD260/OD280<1.6表示有蛋白質污染，OD260/OD280為1.6～2.0時，表明DNA純度較高[6]。

表2可知，CTAB法提取DNA的OD260/OD280值范圍為1.372～2.370，其中樣品1與樣品3的OD260/OD280值<1.6，表明樣品DNA中的蛋白質未除盡；樣品2與樣品4的OD260/OD280值>2.0，表明樣品出現RNA污染；OD260/OD230值為1.469～1.958，表明樣品DNA中出現酚類物質污染；每0.1 g花生嫩葉可提取約13 μg DNA。DNA簡化法提取DNA的OD260/OD280值一般為1.7～2.0，表明提取的樣品DNA中蛋白質含量都較低；同時，OD260/OD230值一般為2.0～3.0，表明樣品中基本沒有酚類物質污染；每0.1 g花生嫩葉可提取約16 μg DNA。

簡化法提取的DNA樣品中RNA、蛋白質、酚類等物質含量較低，OD260/OD280、OD260/OD230值比較理想，DNA質量較高，且與CTAB法相比，單位質量花生葉片提取的DNA產量較高。DNA提取簡化法DNA提取質量明顯優于CTAB法。

3 討 論

隨著分子生物學的快速發展，以植物DNA為基礎的分子克隆等分子生物技術、DNA標記分析以及基因組重測序的研究不斷深入，獲取高質量的DNA成為相關研究的重要前提。然而花生DNA中往往會蘊含豐富的RNA、蛋白質、多酚類物質和多糖等雜質，影響實驗的進行[7-8]。因此，開發一種更快捷、更高效的DNA提取方法是必要的。周賢達[9]等為解決田間西瓜葉片提取 DNA 雜質較多及逐個樣品提取效率低的問題，開發了一種基于96孔PCR板的西瓜葉片DNA快速提取方法，提取的 DNA濃度為287～573 ng·μL-1，并且DNA提取液中含有較少的蛋白質、酚類及小分子雜質。丁浩[10]等在CTAB裂解后直接添加RNase A，然后再經過一系列的抽提、沉淀、洗滌，獲得高質量的DNA，減少了RNA的污染。陳林楊[11]等在裂解細胞之前，向磨碎的植物材料中加入干擾物清除液，去除植物材料中干擾DNA提取的代謝物，并在后續步驟中進行了一些優化，并且該法應用于CTAB法和Plant DNA Mini Kit試劑盒時DNA的質量均獲得提升。此外，使用高鹽TE緩沖液(1.0～2.5 mol/L NaCl)、DNA沉淀前乙醚和NaCl 以及細胞核裂解之前去除細胞質中的雜質等改良方法，可有效地減少多糖、多酚類雜質污染，提高DNA提取質量[12-14]。

本研究基于傳統的CTAB法，對提取花生葉片DNA進行如下改進：① 以燒制成圓球狀的槍頭與離心管的一體研磨裝置代替了傳統的研缽研磨裝置；② 在水浴裂解細胞之前加入RNase A；③ 加入異丙醇后，在DNA沉淀時將其迅速分離。與傳統的CTAB法相比，其優越之處在于在保證高質量的前提下，操作簡單易行，時間短，成本低。在樣品預處理階段，直接使用酒精燈燒制成球狀的槍頭在離心管中研磨葉片節省了從研缽向離心管中轉移葉片組織的時間，減少了葉片組織的浪費，相同質量的葉片組織可獲得較多的DNA產量，同時免去了滅菌、清洗研缽的繁瑣工作。

此外，與使用自動化樣品研磨儀器相比，降低了花生葉片DNA的提取成本；另外，在DNA沉淀階段，在低溫放置的異丙醇加入離心管時，接觸面會產生絮狀DNA沉淀，迅速將沉淀分離，可減少多糖、蛋白質、多酚類等物質的含量，從而提高DNA的質量與純度，同時也減少了DNA沉淀時所用的時間。提取同樣規模的組織樣品，改進法可以節省約二分之一的時間，并且其提取DNA的質量、純度以及產量均優于傳統CTAB法。此外，該改進方法在PlantZol試劑盒(TRAN，北京)提取的DNA質量也得到相應提升。該方法可作為一種快速高效的花生葉片DNA提取的簡易方法，適用于分子生物學實驗和高通量測序等后續研究。