大麥成熟胚愈傷組織誘導、繼代及分化研究

李晨，謝曉東，王景太，崔春陽，王萬坤，陳小強

大麥成熟胚愈傷組織誘導、繼代及分化研究

李晨，謝曉東，王景太，崔春陽，王萬坤，陳小強通信作者

（天津農學院 農學與資源環境學院，天津 300384）

以大麥品種G1614成熟胚為研究對象，以MS培養基為基本培養基，探討2,4-D質量濃度、碳源和成熟胚切割方式對大麥成熟胚愈傷組織誘導的影響，以及NAA/KT配比對大麥愈傷組織分化的影響。結果表明：2,4-D質量濃度為5 mg/L時，大麥成熟胚出愈率較高；30 g/L蔗糖作為碳源時，大麥成熟胚愈傷誘導率較高；縱切大麥成熟胚會促進大麥愈傷組織的誘導；在分化培養基中添加0.5 mg/L NAA和4.0 mg/L KT時，可使大麥愈傷組織獲得較高的分化率。

大麥；成熟胚；愈傷組織；分化

大麥（L.）屬禾本科植物，為第四大谷類作物，其品種遺傳改良研究一直倍受重視[1]。目前，大麥主要作為啤酒生產的原料以及飼料作物使用。我國大麥的年需求量巨大且逐年增加，而國內大麥由于產量和品質等因素的制約難以滿足國內市場的巨大需求，導致我國大麥嚴重依賴于進口，這在一定程度上制約了大麥及其相關產業的發展。因此，如何提高大麥的品質和產量成為我國大麥研究的重點。

組織培養在生物工程育種中扮演了十分重要的角色，是生物工程研究的基礎，是遺傳轉化、植物改良等研究的重要環節之一，在水稻、小麥等禾本科作物上均有廣泛應用[2-8]。本研究以MS培養基為基本培養基，以大麥品種G1614的成熟胚為研究對象，研究激素、碳源和切割方式對大麥成熟胚愈傷誘導、繼代及分化的影響，旨在優化大麥遺傳再生體系，改良大麥產量與品質，同時對大麥轉基因等方面研究也具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大麥品種G1614種子成熟胚。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基基本組成

誘導愈傷培養基1：MS＋30 g/L蔗糖＋2,4-D＋7 g/L瓊脂（pH＝5.8～6.0），2,4-D質量濃度分別為3、4、5 mg/L。

誘導愈傷培養基2：MS＋碳源＋6 mg/L 2,4-D＋7 g/L瓊脂（pH＝5.8～6.0），在縱切條件下，不同碳源濃度分別為30 g/L蔗糖、20 g/L蔗糖＋10 g/L麥芽糖或30 g/L麥芽糖。

分化培養基：MS＋30 g/L 蔗糖＋NAA/KT＋7 g/L瓊脂（pH＝5.8～6.0），NAA/KT濃度分別為0.3/3.0、0.3/4.0、0.3/5.0、0.4/3.0、0.4/4.0、0.4/5.0、0.5/3.0、0.5/4.0、0.5/5.0 mg/L。

1.2.2 大麥種子預處理

試驗接種前，將保存于4 ℃冰箱的大麥種子取出，25 ℃水中浸泡14～16 h，剝除泡好種子的穎殼，在超凈工作臺中用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～5次，5%次氯酸鈉處理15 min，再用無菌水沖洗3～5次。

1.2.3 大麥種胚的獲取與接種

在超凈工作臺中用無菌解剖針將消毒處理后大麥籽粒的胚挑出，進行整胚、縱切、橫切3種處理，然后接種到培養瓶中，每瓶接種6個，每處理接種25瓶。在黑暗條件下培養15 d后，進行數據統計。

1.2.4 大麥成熟胚愈傷組織的繼代

接種15 d后，將G1614成熟胚所誘導的愈傷組織轉接到新鮮的繼代培養基中，繼代培養基為1.2.1中愈傷誘導最優培養基，每周繼代1次，共繼代3次。

1.2.5 大麥愈傷組織的分化

將連續繼代3次之后的愈傷組織進行分化研究，選用KT和NAA為激素，分化培養基配方見1.2.1。每瓶接種5個愈傷組織，每處理接種20瓶，15 d后統計計算愈傷組織分化率。

1.3 培養條件

愈傷組織誘導和繼代培養：25 ℃，黑暗條件。愈傷組織分化培養：25 ℃，光照16 h/d。

1.4 數據統計

出愈率（%）＝大麥成熟胚出愈塊數/大麥種胚接種個數×100％

分化率（%）＝大麥分化愈傷塊數/大麥愈傷接種塊數×100％

數據采用SPSSAU數據分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 2,4-D質量濃度對G1614縱切成熟胚出愈率的影響

由表1可知，在添加30 g/L蔗糖的培養基中，將大麥種子胚縱切，2,4-D質量濃度為5 mg/L時，可獲得較高的出愈率，為78.33%。

表1 不同2,4-D質量濃度下大麥成熟胚的出愈率

由表2可知，2,4-D質量濃度和出愈率之間的相關系數值為1.000，并且呈0.01水平的顯著性，說明2,4-D質量濃度和出愈率之間呈顯著正相關關系。

表2 2,4-D質量濃度與大麥出愈率Spearman相關性分析

注：**＜0.01

2.2 不同種類碳源對G1614縱切成熟胚出愈率的影響

由表1可知，2,4-D質量濃度為5 mg/L時，有較好的出愈率，因此在分析碳源對大麥縱切胚出愈率的影響時，選擇含有5 mg/L 2,4-D的培養基為基本培養基，同時添加不同碳源，將大麥種子胚縱切接種于培養基上，得到碳源對G1614縱切胚出愈率的影響。由表3可知，當培養基中添加30 g/L蔗糖時，可使G1614縱切胚具有較高的出愈率。

表3 碳源對大麥縱切成熟胚出愈率的影響

由表4可知，碳源和出愈率之間的相關系數值為0.500，并且＞0.05，說明碳源和G1614縱切胚出愈率之間并沒有相關關系。

表4 碳源和大麥縱切成熟胚出愈率Spearman相關性分析

2.3 切割方式對G1614成熟胚出愈率的影響

由表1和表3可知，當培養基中添加5 mg/L 2,4-D和30 g/L蔗糖時，有較好的出愈率，因此，在研究切割方式對G1614愈傷組織的影響時，選擇添加5 mg/L 2,4-D和30 g/L蔗糖的培養基為基本培養基。由表5可以看出，縱切G1614成熟胚可以得到較高的出愈率。

表5 切割方式對G1614出愈率的影響

由表6可知，切割方式和出愈率之間的相關系數值為0.500，并且＝0.05，說明切割方式和出愈率之間并沒有相關關系。

表6 切割方式和大麥縱切成熟胚出愈率Spearman相關性分析

2.4 G1614成熟胚的繼代培養

G1614成熟胚在接種3 d后開始長出愈傷組織（圖1），隨著誘導時間的逐漸增加，愈傷組織的大小、顏色等形態結構都會發生變化，有的愈傷組織會直接發芽。如果培養基長時間不進行替換，因培養基營養成分的消耗等因素的影響，愈傷組織的生長會受到抑制甚至發生褐變，而影響愈傷質量。因此本研究在愈傷誘導15 d之后對愈傷組織進行繼代處理，繼代培養基為：MS基本培養基＋10 g/L蔗糖＋20 g/L麥芽糖＋6.5 g/L瓊脂＋3.0 mg/L 2,4-D，每周繼代1次，共繼代3次。繼代之后疏松的愈傷組織發生明顯變化，淡黃色致密胚性愈傷組織數量逐漸增多（圖2）。

圖1 G1614初生愈傷組織

圖2 G1614 胚性愈傷組織

2.5 G1614愈傷組織分化研究

對G1614愈傷組織進行分化研究，由表7可知，當NAA/KT濃度為0.5/4.0 mg/L時，愈傷組織分化率可達較高水平。

表7 G1614愈傷組織分化率統計

由表8可知，NAA/KT配比和分化率之間的相關系數值為-0.050，說明NAA/KT配比和分化率間并沒有相關關系。

表8 NAA/KT配比和G1614愈傷組織分化率Spearman相關性分析

本研究結果表明，當培養基配方為MS基本培養基＋0.5 mg/L NAA＋4.0 mg/L KT＋0.25 g/L肌醇＋1 g/L脯氨酸＋1 g/L CH＋30 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂時，對G1614愈傷組織分化效果較為理想。

3 討論與結論

3.1 大麥成熟胚誘導及其影響因素

大麥成熟胚誘導愈傷組織的影響因素眾多，本試驗選取了激素濃度、碳源、種胚處理方式對大麥成熟胚誘導愈傷組織的影響進行研究。

大麥成熟胚出愈率研究結果表明，2,4-D誘導大麥成熟胚愈傷組織的最適濃度為4～5 mg/L，而任江萍等用2.0 mg/L 2,4-D對大麥種胚進行愈傷誘導，獲得較高的誘導率[9]，這與本研究結果存在差異，可能是所選品種不同造成了2,4-D質量濃度對大麥種胚出愈率的影響不同。林國梁等認為添加2.0～5.0 mg/L 2,4-D有利于誘導成熟胚愈傷組織的形成[10]。

大麥成熟胚處理方式對愈傷組織的誘導也有明顯影響，雖然本研究中Spearman分析表明切割方式和出愈率之間并沒有相關關系。但研究發現，對大麥成熟胚進行整胚接種和橫切接種時，在愈傷組織誘導過程中，均有一部分種胚直接發芽，這嚴重影響了愈傷組織的出愈率。而將種胚進行縱切處理，種胚的直接出芽情況明顯減少，同時愈傷組織的出愈率也顯著提高。陳升位等通過４種切割處理對成熟胚出愈率的影響進行分析，發現橫切部分胚芽、橫切部分胚芽-胚根以及縱切部分成熟胚均可提高多棱裸大麥成熟胚的出愈率，橫切部分胚根對出愈率沒有明顯的促進作用[11]。此外，也有研究者將種胚進行刮碎處理，以破壞種胚的完整性，同樣取得成功，并減少了種胚的發芽情況[12]。本研究表明在大麥成熟胚誘導愈傷組織時，將種胚進行縱切，愈傷誘導率較高，這與陸瑞菊等的試驗結果相一致[13]。

不同種類碳源也會影響大麥成熟胚的出愈率。蔗糖是組織培養中最常用的碳源，在植物組織培養中，糖的用量不僅影響培養物的生長速度和生長量，還影響其代謝水平、次生代謝物的合成、以及細胞的形態和發生，是影響植物組織培養成功與否的關鍵因素之一[14]。本研究表明，在碳源質量相同時，使用蔗糖和麥芽糖（1∶2）比單純使用蔗糖做碳源時的愈傷組織出愈率略高，Spearman分析表明沒有顯著相關性，說明碳源的成分和濃度雖然也會對大麥成熟胚誘導愈傷產生一定的影響，但影響不大。有研究表明，由于培養基的滲透壓發生了變化從而對大麥成熟胚的出愈率產生了一定的影響。徐鳳在以節節麥幼胚為試驗材料、碳源為誘導因素的研究中也表明，碳源種類對節節麥幼胚愈傷組織的誘導沒有顯著性影響[15]。呂芝香認為葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖等碳源對培養組織生長速度雖有差異，但都是良好的碳源[16]。

3.2 愈傷繼代及NAA/KT濃度配比對大麥愈傷組織分化的影響

大麥成熟胚愈傷組織分化主要受基因型、激素配比、愈傷組織質量等因素影響[17-18]。大麥成熟胚所誘導的愈傷組織形態和質量各不相同。總體來說愈傷組織分為兩種，一種為疏松透明的非胚性愈傷組織，另一種為淡黃色致密的胚性愈傷組織。本研究選用較好基因型的大麥品種G1614作為試驗材料，在愈傷誘導15 d后對愈傷組織進行繼代處理，結果表明繼代促進胚性愈傷組織的數量明顯增多。前人也有研究結果表明，非胚性愈傷組織可通過繼代轉變為胚性愈傷組織[19]，這有利于愈傷組織分化苗的形成。

在基因型一定的情況下，選擇合適的激素配比是提高愈傷組織分化率的最好方法[20]。有研究表明，6-BA和IAA不同濃度配比對節節麥成熟胚愈傷分化有較大影響[21]。任江萍等認為，添加1.0 mg/L ZT和0.1 mg/L IAA，對愈傷組織誘導分化的效果比較理想[22]。愈傷組織分化培養時期，需降低或完全去掉生長素類物質，才有利于分化苗的形成[23]。添加 l mg/L 6-BA、2,4-D 對抑制愈傷組織的分化有明顯效應[22]。本研究中將NAA/KT兩種激素進行組合試驗，結果表明NAA/KT不同濃度配比對大麥愈傷組織分化率的影響明顯不同，從所選幾個濃度來看，0.5 mg/L NAA配比4.0 mg/L KT，對G1614成熟胚愈傷組織分化效果較好。

3.3 結論

本研究得到如下結論：

（1）在愈傷誘導過程中，不同2,4-D質量濃度下大麥成熟胚愈傷誘導率存在差異，2,4-D質量濃度為5 mg/L時，大麥成熟胚出愈率較高。

（2）在愈傷誘導過程中，切割方式對大麥成熟胚出愈率影響沒有顯著性差異，但縱切胚和整胚與橫切胚接種出愈率存在差異，縱切種胚的直接出芽情況明顯減少。因此，誘導愈傷組織時，將大麥成熟胚進行縱切處理可獲得較高的出愈率。

（3）大麥品種G1614愈傷最適分化培養基為：MS基本培養基＋0.5 mg/L NAA＋4.0 mg/L KT＋0.25 g/L肌醇＋1 g/L脯氨酸＋1 g/L CH＋30 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂。

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Study on callus induction, subculture and differentiation of mature embryo of barley

LI Chen, XIE Xiao-dong, WANG Jing-tai, CUI Chun-yang, WANG Wan-kun, CHEN Xiao-qiangCorresponding Author

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, G1614 was used as plant materials. The effects of different concentrations of 2,4-D, different kinds and concentrations of carbon source, and different cutting ways to mature embryos on the callus induction of mature embryos from barley G1614 were studied with MS medium as basic medium. And the effects of different concentrations of KT and NAA on the differentiation of barley callus were also studied. The results showed that inducing rate of callus were higher at 5 mg/L 2,4-D. Callus induction rate of mature barley embryos using 30 g/L sucrose as carbon source was higher. The induction rate of barley callus was promoted by longitudinal cut of mature embryo. The addition of 0.5 mg/L NAA and 4.0 mg/L KT in the differentiation medium resulted in a higher differentiation rate of G1614 callus.

barley; mature embryo; callus; differentiation

S512.3

A

1008-5394（2019）02-0008-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.02.002

2019-03-06

天津農學院大學生創新創業訓練計劃（201801024）

李晨（1996-），女，本科在讀，研究方向：種子科學與工程。E-mail: 2450370740@qq.com。

陳小強（1976-），女，副教授，博士，主要從事植物細胞工程及遺傳育種相關工作。E-mail: chenxia9663@126.com。

責任編輯：宗淑萍