超高效液相色譜法測定大鼠血漿中左氧氟沙星質量濃度*

邱妍川 ，劉 陽 ，鐘 玲 ，楊宗發 △

（1.重慶醫藥高等專科學校，重慶 401331； 2.重慶藥友制藥有限責任公司，重慶 401121）

左氧氟沙星可用于治療呼吸道、泌尿道、皮膚和軟組織感染[1-3]。其市售口服劑型以片劑、膠囊劑為主，將其制成新劑型胃漂浮緩釋微丸，可延長藥物在胃中的停留時間，使藥物在胃中充分釋放，提高胃部疾病的局部療效；同時，因該劑型可增加藥物在胃及小腸上部的吸收，穩定血藥濃度，故可提高其口服生物利用度[4-6]。為進一步提高該制劑療效，本研究中給予大鼠灌胃自制左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸，并建立了測定大鼠血漿中左氧氟沙星質量濃度的超高效液相色譜（UPLC）法。現報道如下。

1 動物、儀器與試藥

1.1 動物

清潔級SD大鼠，雌雄各半，6周齡，體質量為150～200 g，飼料為基礎飼料，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，使用許可證號為SYXK（渝）2017-0023。

1.2 儀器

1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XS205DU型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；IKA Vortex Genius 3型渦漩混合儀（德國IKA公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；Allegra X-22R Centrifuge型多功能臺式高速低溫離心機（美國Beckman公司）。

1.3 試藥

左氧氟沙星對照品（批號為130455-201607，純度97.3%），環丙沙星對照品（批號為130451-201203，純度84.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；左氧氟沙星原料藥（浙江國邦藥業有限公司，批號為160809，純度＞99%）；左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸（自制）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），配置同填料類型的保護柱；流動相：0.05mol／L 磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈（75∶25，V／V）；流速：0.3mL／min；柱溫：30℃；進樣量：1μL；檢測波長：294nm。

2.2 溶液制備

稱取左氧氟沙星對照品20.55 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲使溶解，再用甲醇定容，搖勻，作為對照品溶液。稱取環丙沙星對照品10.12 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為內標貯備液，精密移取5 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，作為內標溶液。

2.3 血樣處理

取6只SD大鼠，試驗前禁食12 h，灌胃自制左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸（40 mg／kg）。分別于給藥后0.25，0.5，1，2，4，8，12，24 h 時眼眶取血 0.3 mL，置肝素化塑料離心（EP）管中，5000r／min 離心 10min，取血漿，置-20℃冰箱中低溫保存。精密量取大鼠血漿100 μL，置1.5mLEP管中，加入內標溶液50μL和甲醇300μL，渦旋0.5 min，1.2×104r／min 離心 5 min，取上清液，氮氣吹干，加入流動相100μL使殘渣溶解，即得空白血漿樣品。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別取空白血漿樣品，空白血漿+對照品+內標，給藥12 h后的血漿樣品+內標進樣，記錄色譜圖。結果見圖 1。可見，左氧氟沙星與內標環丙沙星分離良好，保留時間分別為3.0 min和3.9 min，血漿中內源性物質不干擾左氧氟沙星的分離和測定，表明專屬性良好。

圖1 超高效液相色譜圖

線性關系考察：精密量取不同質量濃度的左氧氟沙星對照品溶液各50 μL，置不同的1.5 mL EP管中，氮氣吹干，加入空白血漿100 μL，配成含左氧氟沙星分別為 0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，12.00，15.00 μg／mL的含藥血漿樣品，照2.3項下方法處理樣品后按2.1項下色譜條件進樣分析，以血漿質量濃度（C）為橫坐標、左氧氟沙星與內標的峰面積之比（R）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程R=12.018C+0.848，r=0.999 4（n=7）。結果表明，血漿中左氧氟沙星質量濃度的線性范圍為0.20～15.00 μg／mL。大鼠血漿中左氧氟沙星檢測限為 0.20 μg／mL，RSD為 4.6%（n=7）。

相對回收率試驗：分別用2.3項下處理好的空白血漿樣品與對照品溶液配制高、中、低質量濃度和定量限質量濃度（12.00，5.00，0.50，0.20 μg／mL）的血漿樣品，按2.1項下色譜條件進樣分析，按線性回歸方程計算各質量濃度的實測值。質量濃度實測值除以理論值的百分比即為相對回收率。結果見表 1。

表1 回收率試驗結果（n=6）

提取回收率試驗：精密量取不同質量濃度的左氧氟沙星對照品溶液50 μL，置不同EP管中，氮氣吹干，加入空白血漿100 μL，按2.3項下方法處理，制得高、中、低質量濃度及定量限質量濃度水平（12.00，5.00，0.50，0.20 μg／mL）的提取回收率供試品溶液。按2.1項下的色譜條件進樣分析，結果平均提取回收率介于80.61%～85.44%（n=6），詳見表 1。

精密度試驗：精密吸取空白血漿100 μL，置1.5 mL EP管中，加入對照品貯備液及甲醇適量，制成含左氧氟沙星分別為 12.00，5.00，0.50，0.20 μg／mL 的高、中、低及定量限4個質量濃度水平的血漿樣品，每個質量濃度配制6份，按2.3項下方法處理，進樣1 μL，同一樣品，1 d內測定6次，計算日內變異；同一樣品，每天測定1次，連續測定6 d，計算日間變異。結果見表 2。

表2 精密度試驗結果（n=6）

穩定性試驗：依法制備高、中、低質量濃度的血漿樣品，分別考察室溫放置12 h，-20℃條件下冷凍12 d，血漿樣品3次凍融后再處理的穩定性。結果顯示，測得左氧氟沙星質量濃度與真實質量濃度的偏差均小于15%，表明樣品在3種條件下均能保持穩定。詳見表 3。

表3 穩定性試驗結果（n=6）

2.5 藥-時曲線與藥代動力學參數

灌胃給予大鼠自制左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸，其平均藥-時曲線見圖 2。以3P87軟件計算藥代動力學主要參數。結果半衰期（t1／2）為（7.51 ±1.04）h，藥 -時曲線下面積（AUC0-t）為（119.73 ±11.34）μg／（mL·h），達峰時間（tmax）為（2.62 ±0.79）h，峰質量濃度（Cmax）為（7.91 ±1.45）μg／mL。

圖2 平均藥-時曲線（n=6）

3 討論

在血樣處理時，采用了加甲醇去除蛋白的方法，并與固液萃取法對比，發現均能較好地去除色圖譜中內源性雜質對左氧氟沙星測定的干擾，但固液萃取操作較復雜[7]，且成本更高，因此選擇了前法；左氧氟沙星生物樣品中藥物質量濃度的測定方法采用了內標法，且選擇結構相似的環丙沙星作為內標物，因環丙沙星具有相似的回收率，避免了處理過程中主藥回收率偏低的問題。

目前，左氧氟沙星生物樣品檢測以高效液相色譜法居多[8-11]，但本試驗中選用了超高效液相色譜法，左氧氟沙星出峰快，流動相流速低，大大縮短了檢測時間，減少了流動相的使用，提高了試驗效率，節約了成本。另外，有文獻采用超快速液相色譜-串聯質譜法進行檢測，雖也縮短了檢測時間，但成本過高，操作煩瑣，因此選用UPLC法測定更具有優勢[12-13]。

該分析測定中配備了高靈敏度檢測器，檢測器流通池光程為60 mm，比普通檢測器的流通池光程大6倍，靈敏度大大提高。選用了Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，左氧氟沙星色譜峰對稱性好，峰寬較窄，柱效較高。本試驗中還考察了不同流動相比例對左氧氟沙星質量濃度檢測的影響，當流動相中磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈的比例為75∶25（V／V）時，分離情況最好。

綜上所述，本研究中建立的UPLC法簡單、快速、靈敏、準確，適用于大鼠血漿中左氧氟沙星的藥代動力學研究。