小窩蛋白-1在肝癌細胞及間質中的表達及意義

陳甜 張燁瓊 吳藝鋒

原發性肝癌是發病率較高的四大惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率和術后復發率。小窩蛋白-1(Cav-1)是細胞膜上的一種支架蛋白，在多種信號途徑中起重要調節作用，是機體維持正常生理功能所必需的。研究表明，Cav-1在腫瘤的進展中扮演著重要的角色[1]。Cav-1的表達能夠激活腫瘤微環境，與腫瘤相關的成纖維細胞的轉化、腫瘤細胞的侵襲和轉移能力有關。邱艷等[2]研究發現，Cav-1與肝臟損傷的發生有重要的關聯，其在肝臟損傷模型小鼠中的表達顯著上升。但就目前而言，Cav-1在肝癌細胞及其間質的表達水平尚不明確。本研究選取80例肝癌及其癌旁組織標本為研究對象，檢測其中Cav-1的表達情況，旨在分析其與肝癌臨床病理特征及預后的關系。

資料與方法

一、一般資料

80例肝癌及其癌旁組織標本，納入標準：(1)診斷均符合《原發性肝癌診療規范(2011年版)》標準[3]，且經病理確診；(2)行治療性肝大部切除或部分切除術的原發性肝癌患者，獲得活體組織標本；(3)術前均未行任何治療；⑷均簽署知情同意書；排除標準：(1)復發性宮頸癌；(2)合并其他惡性腫瘤；其中男58例，女22例。年齡(58.12±7.85)歲。肝功能A級53例，B級27例。右半肝切除25例，左半肝切除27例，聯合兩個肝葉切除28例。根據國際抗癌聯盟的分類組織學分級Ⅰ級 0 例、Ⅱ級 16例、Ⅲ級 64 例。

二、方法

(一) 免疫組化的方法 將所取得的肝癌及癌旁組織經10%甲醛溶液浸泡后采用石蠟包埋，制作切片，厚度為4 μm。選擇相應的試劑盒行免疫組化染色，具體過程為：組織切片經處理后與一抗孵育過夜，磷酸鹽(PBS)緩沖液沖洗3次，3 min/次。與生物素標記的羊抗兔IgG孵育30 min。隨后與過氧化氫酶標記的鏈霉親和素室溫孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次。然后DBA(0.02%3,9-氨基聯苯胺的Tris-HCl溶液，pH 7.6)中染色5 min，經蘇木精復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，封片后在顯微鏡(高倍鏡，×400)下觀察Cav-1的表達情況。

(二)陽性結果的判定 以已知陽性肝組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。以半定量的積分法判斷Cav-1的表達情況，由兩位病理醫師在雙盲的情況下進行。分為陰性(0分)、弱陽性(1分)、強陽性(2分)三個等級，其中陰性為不著色，弱陽性為彌漫弱陽性，染色強陽性細胞數≤30%；強陽性為染色強陽性細胞數≥30%[3]。最終結果取兩位病理醫師的平均數，低表達0～1分，高表達1.5～2分。抗Cav-1購自美國Cambridge公司，DBA試劑盒購自武漢博士德生物制藥有限公司，整個免疫組化過程嚴格按照試劑盒操作說明進行。

三、 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件。計數資料采用頻數表示，組間比較采用卡方檢驗，Cav-1與各臨床病理參數之間的相關性采用spearman相關性檢驗進行。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 Cav-1在肝癌細胞、癌旁細胞及其間質中的表達情況

Cav-1在癌旁肝細胞中的表達主要在細胞質，而在肝癌細胞膜和間質均有所表達。Cav-1在間質中的表達主要集中于血管壁。經統計分析發現，Cav-1在肝癌細胞中表達顯著高于癌旁組織，在肝癌間質的表達明顯低于癌旁間質，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 Cav-1在肝癌細胞、癌旁細胞及其間質中的表達情況

二、Cav-1與肝癌實質及間質組織各臨床病理參數之間的關系分析

Cav-1在肝癌實質中的表達與肝硬化、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(P<0.05)。見表2。Cav-1在肝癌間質中的表達與最大徑，是否多發，是否有衛星、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(P<0.05)。見表3。

討 論

小窩(caveolae)是一個直徑為50～100 nm的膜結構，主要由細胞膜表面內陷而形成，是各種信號分子和信號通道的“整合器”，是細胞膜生物功能的重要結構基礎。小窩(caveolin)是小窩結構形成的重要蛋白，對小窩的形成至關重要，在細胞吞噬、脂類運輸和代謝、細胞增殖、分化和凋亡方面有重要的生理功能，與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關[4]。小窩蛋白被認為是參與惡性轉化和惡性發展的關鍵因子。Cav-1能夠維持膽固醇的穩態，在調控細胞信號傳導(表皮生長因子受體、C反應蛋白、Src家族酪氨酸激酶)中也有重要作用。Cav-1被認為是抑癌基因或癌基因，其在一些腫瘤如乳腺癌、小細胞型肺癌中呈低表達，而在另一些腫瘤如食管癌[5]、前列腺癌、胰腺癌中呈高表達。

表2 Cav-1在肝癌實質中的表達與各臨床病理 參數之間的關系分析

本研究通過檢測Cav-1在肝癌及其間質中的表達發現，Cav-1在肝癌細胞中表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，這與劉振華等[6]研究結果相似。本研究結果顯示，Cav-1與肝硬化、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(P<0.05)。這提示Cav-1與肝癌的侵襲、轉移有關。Cav-1的表達可導致E-鈣黏素的減少，蔡曉曼等[7]研究表明，Cav-1可能通過調節E-鈣黏素的表達而影響食管癌的轉移，這也許可以解釋Cav-1 過表達的肝癌細胞遷移和侵襲能力提高。王冰等[8]研究結果顯示，原發性肝癌組織中Cav-1蛋白的表達顯著低于肝硬化組織。這可能與肝硬化導致肝結構的紊亂，進一步破壞血液循環，引起肝細胞缺血、缺氧有關。本研究還發現，Cav-1與衛星結節雖然無顯著相關性，但有正相關趨勢。張帥等[9]研究認為，Cav-1能促進肝星形細胞的增殖、遷移來修復肝癌損傷的肝細胞以及促進肝組織再生。本研究未發現顯著性差異可能與癌細胞侵入到衛星結節形成之間受到了其他因素的影響。本研究還發現，Cav-1在肝癌間質的表達明顯低于癌旁間質(P<0.05)。但Cav-1在間質中的高表達與最大徑、是否多發、是否有衛星、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(P<0.05)。Cav-1可能與腫瘤血管的形成有關，國外蛋白質組學分析顯示，Cav-1—/—的乳腺成纖維細胞可大量分泌促血管生成因子[10]。而本研究發現，Cav-1在間質中的表達主要在血管壁上，其促進肝癌的侵襲、遷移可能在一定程度上與其促進間質血管生成有關。本研究的局限之處在于，Cav-1表達與腫瘤進展之間的關系及分子水平仍未明確，在下一步的研究中將著重進行探討。

表3 Cav-1在肝癌間質中的表達與各臨床病理 參數之間的關系分析