肝硬化并門靜脈血栓脂代謝相關(guān)差異蛋白的研究

熊靜平 范曉棠 張躍新

門靜脈血栓(Portal vein thrombosis，PVT)指肝臟的門靜脈主干、肝內(nèi)分支、脾門靜脈、腸系膜上及下靜脈的血栓形成。門靜脈血栓在普通人群中發(fā)病罕見，過去認(rèn)為PVT同樣是肝硬化的罕見并發(fā)癥，近年來，伴隨著PVT的診斷技術(shù)的不斷更新和普及，PVT確診率也在不斷提高。Handa等[1]關(guān)于肝硬化患者PVT患病率的研究結(jié)果顯示PVT患病率可高達(dá)10%～20%。

陳鋒等[2]的Meta分析研究結(jié)果顯示血脂異常(血HDL水平降低、TG水平升高)是靜脈血栓的危險(xiǎn)因素。血脂異常往往與脂蛋白的代謝相關(guān)。肝硬化PVT在其發(fā)生和發(fā)展的過程中是否存在脂蛋白的變化，可以從肝硬化患者脂蛋白變化的角度出發(fā)，觀察PVT發(fā)生、發(fā)展中有變化的脂蛋白，探討其是否與肝硬化PVT的發(fā)病有關(guān)。

iTRAQ作為一種定量方法，已被證明在研究許多疾病[3-4]中是有效和準(zhǔn)確的。在本研究中，我們用iTRAQ結(jié)合色譜質(zhì)譜分析研究了22例PVT患者和23例非PVT患者的血清樣本，篩選兩組間血清的脂蛋白相關(guān)差異蛋白，并對(duì)三個(gè)與脂肪代謝有關(guān)的蛋白行進(jìn)一步分析。這些差異蛋白可能與肝硬化合并門靜脈血栓的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，為肝硬化門靜脈血栓的潛在生物標(biāo)記物。

資料與方法

一、一般資料

所有的病例均來自2015年11月至2016年11月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染疾病中心住院診治的自身免疫性肝病相關(guān)肝硬化、酒精性肝硬化及隱匿性肝硬化的患者(為避免病毒性肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者血清中有病毒復(fù)制影響蛋白質(zhì)的質(zhì)和/或量，排除乙肝肝硬化及丙肝肝硬化患者)，研究方案及研究內(nèi)容均獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在患者簽署了知情同意后靜脈采血5 mL,于4℃冰箱靜置2 h后3 000 r/min離心。10 min后，取上清液置于EP管中-80℃冰箱冷凍。

二、 病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

肝硬化診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，肝硬化合并PVT與未合并PVT采用彩色多普勒超聲或(和)計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除布加綜合征、肝腫瘤和其他惡性腫瘤、肝移植、非肝臟疾病并PVT，使用抗血小板或抗凝藥物的病例。

三、 與脂肪消化吸收相關(guān)差異蛋白質(zhì)篩選及生物信息學(xué)分析

使用去血清高豐度親和色譜柱Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Human 14去除高豐度蛋白質(zhì), 得到低豐度組分溶液。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量, 各樣品分別取100 μg肽段，按照AB SCIEX公司iTRAQ標(biāo)記試劑盒說明書[6]進(jìn)行標(biāo)記。將每組標(biāo)記后的肽段混合，采用Agilent 1 260 infinity II HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。每份樣品采用納升流速Easy nLC系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。經(jīng)分離后的血清樣本用Q-Exactive質(zhì)譜儀做質(zhì)譜分析。用KAAS (KEGG Automatic Annotation Server)軟件[7]對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher’s Exact Test)，評(píng)價(jià)與脂蛋白相關(guān)差異蛋白質(zhì)及脂蛋白相關(guān)差異蛋白在脂肪消化和吸收通路中的富集水平。

結(jié) 果

一、兩組間檢測(cè)的脂肪代謝相關(guān)蛋白

兩組間共檢測(cè)出800個(gè)蛋白，與脂肪代謝相關(guān)的蛋白共有17個(gè)，其中7個(gè)蛋白在兩組間有差異。其中APOA1上調(diào)，APOB、APOC1、APOC2、APOC4、APOM、FABP1下調(diào)見表1。

表1 兩組間脂蛋白相關(guān)蛋白與兩組間差異蛋白

二、 兩組間檢測(cè)的脂肪代謝相關(guān)差異蛋白的GO注釋

APOC1與羧酸代謝過程相關(guān)；APOA1、APOB與體內(nèi)平衡過程相關(guān)；APOC4、APOC2與小分子生物合成的過程相關(guān)；APOA1與有機(jī)氮化合物生物合成的過程相關(guān)；APOC1與有機(jī)氮化合物分解過程相關(guān)；APOC1與細(xì)胞胺代謝過程相關(guān)；APOC1與有機(jī)酸生物合成的過程相關(guān)；APOC1、APOC4、APOC2與羧酸生物合成的過程相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOA1與脂類生物合成的過程相關(guān)；APOA1與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生與分化相關(guān)；APOC4、APOC2、APOA1與分解過程的正性調(diào)節(jié)相關(guān)；APOA1與調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與血漿脂蛋白粒子組織相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與復(fù)雜脂蛋白的亞基組織；APOC4、APOC2、APOC1與細(xì)胞酮代謝過程相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1對(duì)細(xì)胞酮代謝過程調(diào)節(jié)相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與血漿脂蛋白粒子重構(gòu)相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與復(fù)雜大分子的重構(gòu)相關(guān)；APOC1、APOC2、APOC4、APOM、APOA1、APOB與甾醇運(yùn)輸相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與膽固醇運(yùn)輸相關(guān)；FABP1與過氧化氫相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。

各功能與脂蛋白數(shù)目的分布情況見圖1。

三、兩組間檢測(cè)的脂肪代謝相關(guān)差異蛋白的KEGG注釋

通過KEGG注釋分析發(fā)現(xiàn)兩組間在脂肪代謝與吸收通路中顯著富集的蛋白共3個(gè)、兩組間脂蛋白相關(guān)差異蛋白共7個(gè)，兩組間在脂肪代謝與吸收通路中顯著富集的蛋白共3個(gè)占兩組間總的差異蛋白(86個(gè))的百分比為3.49%，兩組間所有脂肪代謝與吸收的差異蛋白占總的檢測(cè)蛋白(800個(gè))的百分比為0.87%。結(jié)果見圖2，可見脂肪代謝與吸收通路中顯著富集的蛋白比例明顯高于脂蛋白相關(guān)差異蛋白比例。

討 論

高密度脂蛋白(HDL)及HDL的載脂蛋白通過抗氧化、抗炎、清除毒性磷脂、改善內(nèi)皮功能保護(hù)血管，發(fā)揮抗血栓和促纖溶作用。Apoa1編碼的載脂蛋白A1(Apoa1)是HDL的主要蛋白質(zhì)成分，在脂多糖的中和與清除方面發(fā)揮了重要作用[8]，可逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇[9]，抑制內(nèi)毒素引起的的炎癥反應(yīng)[10]。Apoa1在肝臟及小腸合成，肝臟損害可以導(dǎo)致對(duì)Apoa1的合成減少，葉文桃等[11]的研究結(jié)果顯示肝硬化的患者Apoa1水平較健康對(duì)照組明顯減少。在本項(xiàng)研究中，肝硬化PVT組Apoa1的水平較肝硬化非PVT組增加(Ratio=1.98112)。與HDL抗靜脈血栓形成的作用相反，其原因有待進(jìn)一步探討。

Mahfouz等[12]的研究結(jié)果表明，低密度脂蛋白(LDL)可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞在積聚、血管平滑肌細(xì)胞增殖及向內(nèi)皮下遷移，吞噬大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，最后形成血栓。APOB是LDL受體的配體，它清理體內(nèi)低密度脂蛋白，參與合成與分泌VLDL、轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪和膽固醇等。Morelli VM等[13]的研究結(jié)果表明載脂蛋白B水平降低是靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)因素。ApoB在肝臟合成，肝臟損害可以導(dǎo)致對(duì)ApoB的合成減少，葉文桃等[11]的研究結(jié)果顯示肝硬化的患者ApoB水平較健康對(duì)照組人明顯減少。在我們的研究中，APOB在肝硬化PVT組下調(diào)(Ratio=0.74296)。肝硬化PVT的患者可能因APOB水平較肝硬化無PVT患者更低，使肝硬化PVT的患者體內(nèi)低密度脂蛋白水平較無PVT患者高，易形成PVT。

圖1 兩組間脂蛋白相關(guān)差異蛋白的GO注釋

圖2 兩組間脂肪代謝與吸收通路中 顯著富集的蛋白與差異蛋白的分布情況

FABP1在肝臟中表達(dá)具有以下功能：結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸、參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；抗氧化；調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖[14-17]。在本研究中，F(xiàn)ABP1的水平在PVT組下調(diào)(Ratio=0.74745)。FABP1的水平下調(diào)可能導(dǎo)致PVT組患者血脂水平較無PVT組高，易形成血栓。本研究為小樣本的研究，對(duì)于Apoa1上調(diào)、FABP1、APOB下調(diào)導(dǎo)致肝硬化患者引起門靜脈血栓，需要行進(jìn)一步驗(yàn)證并行大樣本功能研究。