微小RNA34a下調沉默信息調節因子1抑制內皮祖細胞功能的機制研究

馬璐 王玉強 何青 楊秀紅 李明 魏延津

261000 濰坊醫學院(馬璐、楊秀紅)；276000 臨沂市人民醫院心內科(王玉強、魏延津)；266000 青島大學(何青、李明)

1 材料與方法

1.1 材料

EGM-2培養基(包括EBM-2培養基和EGM-2MV Single Quots生長因子，FBS，hFGF-B，HYDROCORTISONE，R3-IGF-1，VEGF，hEGF，ASCORBIC ACID)購自美國Lonza公司；H2O2購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、細胞凋亡試劑盒購自日本同仁公司；EndoFectinTM-Max轉染試劑、qRT-PCR試劑盒購自GeneCopoeia公司；miR-34a mimics、miR-34a inhibitors及對照購自上海吉瑪公司；SIRT1抗體購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC分離培養和鑒定 選取年齡約25歲足月順產健康產婦臍靜脈血，采自臨沂市人民醫院產科，經過產婦及其家屬、臨沂市人民醫院醫學倫理委員會的同意。用密度梯度離心法從人臍血中提取內皮祖細胞。通過人臍血EPCs表面特異性抗原以及攝取乙酰化低密度脂蛋白和結合荊豆凝集素1，鑒定為EPC[5]。將細胞置于EGM-2培養基中，置于37 ℃、含5%CO2的培養箱內飽和濕度培養。待細胞生長融合約80%～90%，根據實驗要求傳代。

1.2.2 CCK-8檢測細胞存活率 用3% H2O2與不含胎牛血清的培養基分別配制終濃度為0 μM、100 μM、200 μM、500 μM、800 μM的H2O2。將100 μl培養基中含2.0×105個細胞接種于96孔板中，并置于培養箱內孵育一段時間后，分別選取不同濃度的H2O2處理細胞24 h，用酶聯免疫儀測定波長在450 nm處的吸光度值。重復三次實驗，取平均值。

1.2.3 細胞轉染 將對數生長期的細胞以2.0×105/孔的密度鋪種于6孔板中，待細胞密度達到70%～80%時轉染。轉染時分miR-34a mimics組、miR-34a inhibitors組及各自對照組(mimics control、inhibitors control)。miR-34a mimic或inhibitor被轉染至細胞以模擬過表達miR-34a或抑制miR-34a表達。整個轉染過程按照EndoFectinTM-Max轉染試劑說明操作。

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-34a的表達水平 轉染24 h后用500 μM的H2O2處理細胞24 h。提取總RNA，將miRNA逆轉錄合成cDNA；以RNU6B作為內參基因，檢測miR-34a的相對表達量。……