微小RNA-155和CD4+調節性T細胞與冠狀動脈不穩定斑塊的關系

賈敏 劉震 羅義 雷曉明 楊陽 陳平安

510095 廣州市胸科醫院綜合內科(賈敏)；510180 廣州市第一人民醫院心內科(劉震、羅義、雷曉明、楊陽、陳平安)

冠狀動脈內不穩定斑塊(unstable plague，UP)的形成、破裂及繼發血栓形成是導致急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發生的最重要機制[1]。研究顯示，免疫炎癥在動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展中起重要的促進作用。調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是體內一群免疫抑制功能強大的T細胞亞群，在機體免疫穩態維持中起重要作用[2]。微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)是具有重要轉錄后調節作用的小分子RNA，與免疫炎癥反應的調節相關[3]。本研究旨在探討循環miR-155和外周血CD4+Treg細胞與冠心病(coronary artery disease，CAD)患者UP的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究為回顧性研究。連續入選2016年1月至2018年1月在廣州市第一人民醫院心內科住院并診斷為CAD的患者120例，男性68例，女性52例，年齡54～68歲，平均(61.8±6.9)歲。其中急性非ST段抬高型心肌梗死16例，不穩定性心絞痛56例，穩定性心絞痛48例。入選患者均接受冠狀動脈造影和血管內超聲(intravascular ultrasound，IVUS)檢查。非ST段抬高型心肌梗死和不穩定性心絞痛診斷符合《2011年美國不穩定性心絞痛和非ST段抬高型心肌梗死治療指南》。排除標準：(1)需急診再灌注治療的急性ST段抬高型心肌梗死；(2)心源性休克；(3)嚴重肝腎功能不全、重癥感染、血液系統或自身免疫疾病、惡性腫瘤；(4)合并急性腦血管意外、消化道或泌尿系統等重要臟器活動性出血。

另外選取同期在體檢中心進行健康體檢的健康人群50名作為對照組，其中男性23名，女性27名，年齡48～71歲，平均(60.5±8.3)歲。本研究通過廣州市第一人民醫院倫理委員會審查，入選研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法與分組

1.2.1 血管內超聲-虛擬組織學技術(intravascular ultrasound-virtual histology，IVUS-VH)[4]經冠狀動脈造影后，對明確存在管腔直徑狹窄程度≥50%的冠狀動脈注入硝酸甘油200 U，之后使用iLab超聲診斷儀(Boston Scientific，美國)及Atlantis SR Pro冠狀動脈超聲成像導管(Boston Scientific，美國)，直徑3.6 F，頻率40 MHz，超聲探頭導管在X線透視下沿0.014英寸導引鋼絲進入冠狀動脈。到達狹窄病變處遠端后，自動回撤裝置將導管以0.50 mm/s的速度回撤，同時采集影像數據，錄盤分析。利用主機自帶iMap Basic Viewer軟件構建組織圖像，測定病變血管外彈力膜橫截面積、管腔橫截面積、斑塊負荷及每種成分在斑塊中所占比例，以評價靶病變的斑塊性質。IVUS-VH檢查血管內橫截面積狹窄率超過40%、壞死組織超過10%、且靠近管腔的斑塊定義為UP[4]。據此，將入選的CAD患者分為穩定斑塊(stable plaque，SP)組50例和UP組70例。

1.2.2 循環miR-155水平的檢測 所有研究對象均于清晨8時左右空腹狀態下留取靜脈血標本，置于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)無菌抗凝試管中，2 h內分離血漿，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術[5](Promega公司，美國)對血漿miR-155進行檢測，以人snRNA U6(Human snRNA U6)為內參，定義ΔCt=目的基因(miR-155)Ct-內參(U6)Ct；ΔΔCt=待測樣品中目的基因(miR-155)ΔCt-參照樣品中目的基因(miR-155)ΔCt，相對樣品模板量RQ=2-ΔΔCt(Ct值的含義：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)。以相對樣本模板量表示循環miR-155的相對表達量。

1.2.3 外周血CD4+Treg細胞水平的檢測 所有研究對象均于清晨8時左右空腹狀態下留取靜脈血標本2 ml，置于EDTA抗凝的真空采血管(去熱源與內毒素)，輕輕混勻，標本于4 h內測試完畢。采用直接免疫熒光法，用肝素鈉抗凝全血50 μl后加入10 μl FITC-CD4/APC-CD25二聯抗體，4℃下避光孵育30 min，用于標記CD4+CD25+Treg細胞，溶血洗滌后棄上清，洗滌后加入10 μl抗人Foxp3單克隆抗體于4℃下避光孵育30 min，再次洗滌后用500 μl染色緩沖液重懸，上流式細胞儀(Beckman，美國)分析，結果以CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+Treg細胞的比率表示。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 基線資料

SP組、UP組和對照組的臨床基線資料比較，差異均無統計學意義(均為P>0.05)，見表1。

2.2 血漿miR-155和CD4+Treg水平

對照組、SP組和UP組患者的血漿miR-155和CD4+Treg水平比較，見表2。

2.3 UP組CAD患者血漿miR-155與CD4+Treg水平的相關性

Spearman相關分析顯示，UP組CAD患者的血漿miR-155相對表達量與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平呈正相關(r=0.476，P=0.013)。

2.4 血漿miR-155水平和外周血CD4+Treg水平與CAD患者冠狀動脈斑塊穩定性的關系

采用多因素logistic回歸方法分析包括年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、腎功能不全、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、高敏C反應蛋白、同型半胱氨酸、N末端B型利鈉肽原、血漿miR-155相對表達量、外周血CD4+Treg水平等多個因變量與應變量UP(有UP為1；無UP為0)之間的關系。結果顯示，血漿miR-155相對表達量、外周血CD4+Treg水平均是CAD患者冠狀動脈斑塊穩定的獨立保護因子(OR=0.662，95%CI：0.472～0.819，P=0.011；OR=0.502，95%CI：0.376～0.765，P=0.019)，見表3。

3 討論

動脈粥樣硬化所致的心腦血管疾病是目前危害人類健康的首要疾病，而UP是導致心腦血管事件發生的關鍵。目前，CAD患者冠狀動脈內是否存在UP主要通過侵入性檢查冠狀動脈造影或IVUS等手段來判斷[6]，缺乏對其早期預測和診斷的無創性檢查指標。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應貫穿其起始、進展及至斑塊不穩定的各個階段。CD4+Treg細胞是體內一群免疫抑制功能強大的T細胞亞群，在機體全身及局部免疫穩態維持中起重要作用，其特異性標志為細胞高表達CD25+和Foxp3+。本研究結果發現，UP組患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+Treg細胞的比例明顯低于SP組和對照組，多因素回歸分析顯示，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平是冠狀動脈內斑塊穩定的獨立保護因子。近期研究報道，小鼠動脈粥樣硬化模型外周血和斑塊中CD4+CD25+Foxp3+Treg數量減少、免疫抑制功能降低，而輸注CD4+CD25+Foxp3+Treg能使斑塊明顯變小[7]，提示動脈粥樣硬化形成涉及CD4+CD25+Foxp3+Treg的免疫調控機制，其變化是動脈粥樣硬化和ACS發生和發展的重要原因之一。國內胡英鋒等[8]發現，ACS患者外周血中Treg細胞表達百分比水平和功能顯著低于對照組，并且C反應蛋白、腫瘤壞死因子α等炎癥因子水平顯著升高，而炎癥抑制因子白細胞介素10、轉化生長因子β水平則明顯降低。本研究結果亦顯示，Treg細胞數量和功能活化是影響動脈粥樣硬化斑塊穩定性的重要因素。

表1 3組的臨床基線資料比較

注：B2/C型病變：符合美國心臟病學院基金會(ACCF)和美國心臟病協會(AHA)冠狀動脈病變分型標準B2型和C型

表2 3組血漿微小RNA-155和CD4+調節性T細胞水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與穩定斑塊組比較，cP<0.01

近年研究顯示，循環miRs作為一類單鏈內源性非編碼小分子RNA，在患者生理或病理狀態下的變化早于其他生物標記物，并且具有良好的抗RNA酶降解能力和較高的穩定性，有可能成為某些疾病的特異血清學生物標記物[9]。已有研究證實，miR-155可在T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核/巨噬細胞表達，并對炎癥免疫細胞的激活及免疫炎癥的調節起關鍵作用。本研究結果發現，UP組CAD患者的血漿miR-155相對表達量明顯低于穩定斑塊組，多因素logistic回歸分析顯示，血漿miR-155水平與CD4+Treg細胞表達水平均是冠狀動脈內斑塊穩定的保護因子，而UP組CAD患者的血漿miR-155與外周血CD4+Treg細胞水平呈正相關。Seddiki等[10]研究發現，在胸腺細胞的分化過程中，miR-l55的表達升高可使CD4+Treg細胞Foxp3的表達上調，miR-l55的缺失會導致Treg細胞數量的減少。Yao等[11]通過轉染pre-miR-155和抗miR-155到純化的CD4+Treg細胞中，進行miR-155的過表達與抑制，結果發現轉染pre-miR-155的CD4+Treg細胞中Treg細胞的數量比轉染抗miR-155的CD4+Treg細胞中的多，同時Treg細胞的特異性標志叉頭狀轉錄因子Foxp3表達也明顯上調，上述研究顯示miR-155具有調控Treg細胞上特異標記物的表達進而影響Treg細胞的功能及數量的效應。從本研究結果來看，miR-155可能正性調節Treg細胞表達，進而通過Treg細胞的免疫抑制功能抑制冠狀動脈內斑塊炎癥反應，減緩斑塊進展至不穩定狀態。

綜上所述，CAD患者血漿miR-155的水平可作為判斷和預測冠狀動脈內斑塊穩定性的一種重要血液學生物標記物。其通過正性調節外周血CD4+Treg細胞表達水平，抑制冠狀動脈內及斑塊內局部炎癥反應，可能是維持冠狀動脈斑塊穩定性的重要機制之一。但本研究仍存在樣本量偏小，研究的冠心病人群及觀察的炎癥指標較單一等缺陷，因此，本研究結果和結論有待將來大規模的臨床試驗進一步驗證。

表3 血漿微小RNA -155水平和外周血CD4+調節性T細胞水平與不穩定斑塊的關系

利益沖突：無