血清卵磷脂膽固醇酰基轉移酶活性與冠心病的關系

王玉 于雪 張聞多 王欣越 楊睿悅 王思明 曾潔 唐月明 栗向輝 李紅霞 陳文祥 董軍 季福綏

100730 北京醫院生物化學與分子生物室，國家老年醫學中心(王玉、楊睿悅、王思明、唐月明、粟向輝、李紅霞、董軍)，心內科(于雪、張聞多、王欣越、季福綏)；100730 北京，衛生部臨床檢驗中心(曾潔、陳文祥)

研究發現，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)降低是冠心病(coronary atherosclerosis heart disease，CAD)的獨立危險因素之一[1]。然而，臨床研究中，具有升高HDL-C作用的膽固醇酯轉移蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)抑制劑未取得預期效果[2-3]。卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(lecithin：cholesterol acyltransferase，LCAT，EC 2.3.1.43)是膽固醇逆向轉運過程中的關鍵酶[4-5]，曾被認為是HDL發揮CAD保護作用的重要因素。但由于缺乏簡便、可靠的LCAT活性測定方法，LCAT活性與冠心病的關系仍無定論。我們建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測定LCAT活性的方法，與傳統的同位素示蹤法相比，安全、簡便、精密，可準確評估人群中LCAT的活性。本研究采用HPLC法測定行冠狀動脈造影患者血清的LCAT活性，分析LCAT活性與CAD及其危險因素的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究為病例對照研究。納入2014年11月至2015年8月在北京醫院行冠狀動脈造影的425例患者，年齡17～91歲，男性291例(58.2%)，女性209例(41.8%)。根據冠狀動脈造影結果分為CAD組(341例)和非CAD組(84例)。CAD定義為冠狀動脈造影顯示左前降支、左回旋支、右冠狀動脈及其主要分支中至少有一支血管管腔狹窄程度≥50%[6]；非CAD患者定義為上述血管管腔狹窄程度<50%。收集患者的既往史、個人史、家族史、血壓、血脂和血糖等臨床資料。本研究符合醫學倫理學要求，已通過北京醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

采集血液樣本后，1 h內分離血清后分裝，-80℃冰凍保存待測。測定時將血清樣本融化并使之恢復到室溫，搖勻，采用HPLC測定血清LCAT活性。每次重復測定25～30個樣本、2個質控血清，共進行18次，完成全部樣本的測定。將-80℃凍存的脂質體、血清和質控血清取出，平衡至室溫。用加樣器吸取500 μl的脂質體至冰水浴中的預冷的試管中，再用加樣器精密吸取10 μl血清或質控樣本于脂質體中，37℃溫育1 h； 溫育結束后將試管置于冰水浴中并加入500 μl乙醇終止反應，加入正己烷1 ml，渦旋震蕩20 min抽提脂質；轉移正己烷層500 μl至HPLC樣瓶，減壓干燥，用200 μl的流動相重組，混勻后進行HPLC分析。本研究使用的儀器包括Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent公司，美國)；Nova-Pak C18色譜柱(5 μm，3.9 mm×150 mm，Waters公司，美國)；有機溶劑乙腈、異丙醇、正己烷、無水乙醇等為HPLC級(Fisher Scientific公司，美國)，以及其他試劑，如甲醇、氯仿、磷酸鹽(北京化學試劑公司)。

血清樣本的常規生化指標，如血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、隨機血糖(glucose，GLU)等采用酶法測定；HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)采用勻相法測定；ApoAI、ApoB采用免疫比濁法。所有試劑均為Roche公司產品(瑞士)，按試劑盒說明書于自動生化分析儀(日立7180，日本)測定。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組的一般資料比較

CAD組中LCAT活性顯著高于非CAD組，而男性為(37.3±8.4)nKat/L，女性(36.0±6.8)nKat/L，差異無統計學意義(P>0.05)。此外，兩組的HDL-C、ApoAI和隨機血糖等均有顯著差異(均為P<0.05)，見表1。

2.2 血清LCAT與CAD危險因素的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，LCAT活性與BMI(r=0.09)、TG(r=0.30)、ApoB(r=0.22)和隨機血糖(r=0.09)呈正相關；與HDL-C (r=-0.26)呈負相關，見表2。

2.3 單因素和多因素logistic回歸分析

單因素logistic回歸分析結果顯示，LCAT活性升高是CAD危險因素(OR=3.11，95%CI：1.40～6.91，P=0.005)，在校正年齡、性別、HDL-C、ApoAI、隨機血糖等危險因素后，多因素logistic回歸分析發現LCAT的活性升高仍是CAD危險因素(OR=3.28，95%CI：1.27～8.50，P=0.014)。

3 討論

早期研究認為，LCAT活性升高是CAD的保護因素。Sethi等[7]采用外源底物法測定缺血性心臟病和正常對照組人群血清的LCAT活性，去除年齡和性別因素后發現，CAD患者的LCAT活性明顯降低，LCAT活性是CAD的保護性因素。然而，既往研究先后采用內/外源底物法，測定樣本血清LCAT活性[6，8-9]，發現LCAT活性與TC、TG、ApoB等CAD危險因素正相關，且CAD組的LCAT活性較對照組高(P=0.027)，故LCAT活性可作為AS亞臨床診斷和預測的標志物。但是，既往研究中LCAT活性測定方法復雜多樣。其中，內源底物法受血清脂質組成的影響，不能反映血清LCAT的真實活性[10-11]；外源底物法設計各異[12-14]，去除底物和內源脂質影響的程度不同，且脂質體制備復雜，不同方法測定的LCAT活性可能具有不同的生物學意義，導致結果缺乏可比性。針對以上各種問題，我們建立了一種簡便、精密、可靠的HPLC測定人血清LCAT活性的方法[15]，且基本不受內/外源底物和物質的影響，適用于高通量臨床應用。

表1 兩組的LCAT活性與其他參數的差異

表2 LCAT活性與CAD危險因素的相關性分析

LCAT活性與CAD的關系仍有爭議。近期研究發現，LCAT與多種CAD危險因素相關，LCAT可能促進CAD的發生，是CAD的危險因素。但是，多數研究僅評估LCAT活性與CAD危險因素或頸動脈內膜中層厚度的關系，較少有大規模研究評估LCAT活性與CAD的關系。與既往研究結果相似，本研究發現，CAD患者的LCAT活性顯著增高，且LCAT活性與BMI(r=0.09)、TG(r=0.30)、ApoB(r=0.22)和隨機血糖(r=0.09)正相關；與HDL-C(r=-0.26)負相關。校正年齡、性別、HDL-C、ApoAI和血糖等因素后，多因素logistic回歸分析提示LCAT活性升高仍是CAD的獨立危險因素。然而，部分研究發現，LCAT活性與HDL-C正相關。但既往研究樣本量較小，LCAT與CAD的關系仍需更多研究證實。

本研究有一些局限性，包括對照組為冠脈狹窄<50%的患者而非冠狀動脈正常人群，而此類患者可能存在動脈粥樣硬化或為冠心病的高危人群，因此會低估病例/對照組間的差異，對結果造成一定的偏倚。此外，樣本量較小，難以進一步探討LCAT活性與冠心病嚴重程度的相關性。

綜上所述，本研究揭示了LCAT活性升高與多種CAD危險因素相關，是CAD的獨立危險因素，但仍需更多研究證實。

利益沖突：無