套環(huán)法和空氣干燥法建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的比較分析

王 琮, 陳筱雪, 楊少玲, 王鳳翎, 范林艷, 賀倩倩

(安徽理工大學(xué)附屬上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院, 上海201400)

腦血管意外是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一, 研究[1]表明易損斑塊和急性腦血管意外有明顯關(guān)聯(lián), 是腦缺血高發(fā)生率的重要原因。多數(shù)的急性腦血管意外是動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破裂和繼發(fā)血栓所致。因此，易損斑塊的特性及干預(yù)斑塊破裂導(dǎo)致的一系列病理生理過(guò)程成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。有關(guān)粥樣硬化易損斑塊的組織學(xué)研究主要依賴動(dòng)物模型，由于兔在脂蛋白代謝方面與人有相似之處，且對(duì)血脂的清除能力低，進(jìn)食含高膽固醇飼料后，短時(shí)間內(nèi)可形成高膽固醇血癥，容易產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。因此，兔常用于構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊動(dòng)物模型。但有研究[3,4]指出單純給予兔高脂飲食，其產(chǎn)生的動(dòng)脈斑塊更偏向于黃瘤病，而非類似于人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。所以我們?cè)噲D通過(guò)不同方法來(lái)建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型，尋找更高效的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性新西蘭白兔20只，3～5月齡, 體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購(gòu)自上海奉賢騰達(dá)兔業(yè)[SCXK(滬)2014-0003]，飼養(yǎng)于上海市奉賢輝煌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)[SYXK(滬)2013-0047]。高脂飼料購(gòu)自上海靈樸生物科技有限公司[蘇飼證(2014)01008]，配方(OC30002)如下： 普通飼料 74.5%，豬油10%，膽固醇0.5%，蛋黃粉10%，蔗糖5%。動(dòng)物房溫度18～24℃、自然光照，晝夜交替12 h，每只兔喂飼料100 g/d，自由飲水，單籠喂養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則對(duì)實(shí)驗(yàn)兔給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

Vivid E9超聲診斷儀購(gòu)自美國(guó)GE公司; 酶標(biāo)儀(450 nm)購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器公司，兔低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組 隨機(jī)分成2組，每組各10只。A組行頸總動(dòng)脈內(nèi)膜空氣干燥法： 麻醉后(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛, 3～3.5 mL/kg)備皮、消毒, 頸部正中切口切開，充分暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈。動(dòng)脈夾夾閉血管近心端及遠(yuǎn)心端。4號(hào)頭皮針沿血管長(zhǎng)軸刺穿，生理鹽水沖管后通氣(120 mL/min) 5 min，隨后再次往管腔內(nèi)注入生理鹽水，松開動(dòng)脈夾，按壓止血。待出血停止后，縫合皮膚。B組行頸總動(dòng)脈外膜套環(huán)法： 準(zhǔn)備工作如前，充分暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，將內(nèi)徑1.0 mm的薄壁硅橡膠管套住頸總動(dòng)脈外膜，硅膠管均長(zhǎng)5 mm。硅橡膠開口處使用粘合劑封閉。術(shù)后高脂飼料喂養(yǎng)12周。

1.3.2 觀測(cè)指標(biāo) ①ELISA法測(cè)量血漿TC、TG及LDL： 術(shù)后高脂飼料喂養(yǎng)0周、4周及8周, 分別經(jīng)耳中動(dòng)脈用EDTA真空抗凝管取血2 mL, 1 118 ×g離心5 min，取血漿棄紅細(xì)胞，再6 440 ×g離心3min，取上清-80℃保存。待血樣收集完畢按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。②兔頸動(dòng)脈超聲檢查：術(shù)后高脂飼料喂養(yǎng)4周、8周及12周，分別使用GE vivid E9超聲診斷儀檢查2組兔頸動(dòng)脈。兔備皮后仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，沿著氣管兩側(cè)找到頸總動(dòng)脈，探頭選用9L，頻率8～10 MHz，調(diào)節(jié)至圖像清晰，先長(zhǎng)軸再短軸，自上而下地檢查頸總動(dòng)脈，觀測(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜、管徑及斑塊形態(tài)。③兔頸總動(dòng)脈病理學(xué)觀察： 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空氣栓塞法處死全部動(dòng)物。取有斑塊的頸總動(dòng)脈段，送醫(yī)院病理科行HE染色后做病理學(xué)觀察。

表1 兔血清TG、TC、LDL的濃度 mmol·L-1

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以s表示，同一組高脂飼料前后的血脂水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂水平

高脂飲食4周后血清TG、TC、LDL的濃度升高(P＜0.05)，并持續(xù)升高。而同一時(shí)間A組與B組間上述指標(biāo)未見明顯差別(P＞0.05)(表1)。

2.2 超聲檢測(cè)頸總動(dòng)脈

A、B組白兔頸總動(dòng)脈內(nèi)中膜在8周左右明顯增厚，且B組頸總動(dòng)脈狹窄處內(nèi)中膜增厚較明顯，血流速度也較快(表2、表3)。4周時(shí)兩組實(shí)驗(yàn)兔管壁均未見明顯斑塊，管腔內(nèi)血流信號(hào)充盈良好。而8周時(shí)硅膠環(huán)組部分實(shí)驗(yàn)兔頸總動(dòng)脈內(nèi)可見小斑塊突向管腔，彩色多譜勒血流圖(CDFI)可見斑塊處血流繞行，未見明顯狹窄(圖1)。12周時(shí)，兩組實(shí)驗(yàn)兔頸總動(dòng)脈內(nèi)均見斑塊回聲。

2.3 病理學(xué)檢查

12周時(shí)A、B兩組兔未手術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈僅可見內(nèi)膜不規(guī)則增厚, 內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性尚好(圖2A和圖2B)。而手術(shù)側(cè)可見內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整, 伴有不同程度的連續(xù)性中斷, 病灶內(nèi)膜下見泡沫細(xì)胞, 表層纖維帽結(jié)構(gòu)斷裂, 彈力纖維破壞變薄, 平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜增生,可見斑塊突向管腔(圖2C、圖2E), 且B組(圖2C、圖2D)病變較A組(圖2C、圖2E)更為明顯。

表3 套環(huán)法兔頸總動(dòng)脈超聲檢測(cè)

圖1 二維超聲兔頸動(dòng)脈斑塊

圖2 兔頸動(dòng)脈病理學(xué)觀察

3 討論

高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，實(shí)驗(yàn)中兔在高脂高膽固醇飲食后，4周即可測(cè)得血TG、TC和LDL濃度升高，并隨時(shí)間推移持續(xù)升高。但是單純高脂喂養(yǎng)建模有一定的局限性，比如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)位置不可控，其次兔的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要為纖維增生性病變?yōu)榉€(wěn)定性斑塊，不似人類的易損斑塊[5]。

LeVeen等[6]在1982年首次采用通入干燥氣體直接損傷血管內(nèi)壁, 結(jié)合高脂飲食, 制備兔股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型。此方法對(duì)頸總動(dòng)脈損傷僅局限于內(nèi)膜，不會(huì)影響中膜，雖然內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)與內(nèi)膜增殖的過(guò)程更加接近頸動(dòng)脈疾病的生理過(guò)程，但是影響因素較單一[7]。1997 年，Booth等[8-10]報(bào)道在高脂血癥兔的頸動(dòng)脈外膜植入硅橡膠圈(套環(huán)法)，以得到頸動(dòng)脈斑塊模型，套入硅橡膠一方面人為造成頸總動(dòng)脈狹窄, 改變局部血流動(dòng)力學(xué), 另一方面硅橡膠套的機(jī)械刺激可引發(fā)血管局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈班塊形成。故套環(huán)法可以縮短頸動(dòng)脈斑塊建模時(shí)間。本研究超聲結(jié)果顯示，同樣飼養(yǎng)條件下，A、B兩組兔中未受人為破壞側(cè)的動(dòng)脈，內(nèi)中膜變化出現(xiàn)時(shí)間晚，亦未見斑塊形成。兩組手術(shù)側(cè)頸總動(dòng)脈均在喂養(yǎng)4周見內(nèi)中膜增厚(表2和表3)并在8周和12周時(shí)可陸續(xù)掃查到頸總動(dòng)脈斑塊。B組手術(shù)側(cè)頸總動(dòng)脈斑塊形成較A組早，多數(shù)在8周即可發(fā)現(xiàn)凸向管腔的斑塊回聲。術(shù)后12周B組存活5只兔(存活率50%)，其中3只檢出頸動(dòng)脈斑塊，且斑塊多發(fā)生在狹窄處近心端頸動(dòng)脈段。A組存活4只兔(存活率40%)，僅2只建模成功。

病理學(xué)觀察也證實(shí)了超聲檢查結(jié)果。當(dāng)頸總動(dòng)脈出現(xiàn)斑塊時(shí), HE染色光學(xué)顯微鏡下見動(dòng)脈內(nèi)膜形態(tài)不規(guī)整、不連續(xù), 內(nèi)彈力膜中斷, 顯示不清, 平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜增生, 可見斑塊凸向管腔。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1周B組兔存活率為90%, A組兔存活率為70%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)B組存活率50%，而A組為40%。這可能與A組手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，術(shù)中血流阻斷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，或許可以推測(cè)套環(huán)法較空氣干燥法安全簡(jiǎn)便。