應用于行為學研究中八臂迷宮實驗方法的改良

劉 波, 王 楊, 李志杰

(1. 中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心, 沈陽 110004;2. 遼寧省環境與代謝疾病動物模型研究與應用重點實驗室, 沈陽 110004;3. 遼寧省腫瘤醫院結直腸外科, 沈陽 110042)

八臂迷宮是一種研究動物空間記憶的迷宮模型，主要用于不同藥物處理以及疾病模型下動物學習、記憶、覓食策略、空間認知等多方面的研究[1]。它由八邊形中央區和與其連接的八條工作臂組成。實驗者通過在特定食餌臂末端放入食餌作為對進入該臂的獎賞，而在其余臂內不放食餌或通過刺激手段懲罰實驗動物的方式對實驗動物進行迷宮覓食訓練。動物在饑餓驅使下探索迷宮尋找食餌，通過一定時間的訓練后，可對迷宮各臂進行自由探索并成功躲避沒有食餌的工作臂完成覓食。通過水，電等刺激-應答模塊建立完整的條件、非條件環境刺激，配合視頻采集系統記錄實驗動物覓食或逃避策略，提供靈敏且易于操作的技術以分析不同藥物處理或疾病模型損傷對記憶相關腦區的影響，用于評估發育神經損傷處理對嚙齒類動物空間學習記憶認知的影響[2]。

目前大多文獻采用的傳統八臂迷宮實驗方法在實際操作中的訓練周期長達2～4周。實驗動物成功躲避無誘餌臂端快速找到食餌臂端概率較低，且單次探索時間長或是訓練次數過多，不能在短時間合理訓練頻率下有效評估空間學習記憶能力，無法方便服務于實驗者快速有效完成實驗[2]。為此本實驗應用改良電加熱條件刺激八臂迷宮裝置探索新型八臂迷宮實驗方法。

1 材料與方法

1.1 動物

選取清潔級雄性SD大鼠20只，體質量(200±10)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供[SCXK(遼)2015-0001], 隨機分為2組, 對照組10只按照傳統八臂迷宮方法進行訓練，實驗組10只按照改良方法進行訓練。實驗開始前一周所有大鼠開始控制攝食量，每日定時投喂飼料10 g/只，控制體質量保持在原體質量的80%～85%，飲水不限[SYXK(遼)2017-0004]。并于固定時間對將要進行實驗的大鼠實施撫摸安撫以適應環境，并于實驗開始前禁食12h。

1.2 儀器設備

視頻追蹤系統： Ethovision XT 小動物視頻軌跡行為學分析系統，購自荷蘭Noldus公司; 箱體： 標準大鼠八臂迷宮箱體，尺寸為單臂長425 mm，寬145 mm，高225 mm，購自北京眾實科技有限公司; 獎勵食餌： 經60Co輻照滅菌的市售生瓜子仁; 懲罰裝置： 4個電輔熱裝置，尺寸100 mm×100 mm，購自江蘇省東臺市正龍電熱電器廠; 參考物： 各臂內貼不同形狀參考物(以加強實驗過程中動物對周圍環境的記憶)。

1.3 實驗方法

第1日：讓大鼠適應迷宮環境。將禁食12 h的2組大鼠隨機各再分為5組，每組2只。將迷宮閘門同時打開并在各臂末端及中央區域各投放5個瓜子仁作為食餌，2只大鼠同時放入迷宮中央區域, 讓其自由攝食、探究10 min，每日訓練2次。以大鼠后肢完全進入臂門記為進入該臂1次。

第2日：重復第1日的訓練。實驗人員于訓練開始前輕柔安撫動物5～10 min，使其放松地自由探索迷宮環境。

第3日：迷宮及食餌位置保持不變，每只大鼠單獨進入迷宮訓練，使其大膽獨自探索迷宮環境。每只鼠在單次訓練結束后用體積分數75%酒精噴灑擦拭箱體以去除氣味滯留。

第4日：為對照組大鼠設定特定食餌臂以及空食餌臂，例如1號動物食餌臂1，3，5，6; 空食餌臂為2，4，7，8。實驗組大鼠設定固定食餌臂及電加熱懲罰臂，例如： 1號動物食餌臂為2，4，5，8; 電加熱懲罰臂為1，3，6，7。在每個食餌臂投放1顆瓜子仁作為食餌。電加熱懲罰裝置溫度設定為60 ℃。電加熱懲罰臂末只放置電加熱裝置而不放食餌。實驗者將大鼠輕柔地放入至八臂迷宮中央，適應環境30 s后同時打開閘門讓其自由探究直至吃完食餌或總探索時間達10 min結束訓練，每日訓練2次。

第5至第7日；重復第4日的訓練。

第8日：連接視頻軌跡跟蹤采集系統，設定大鼠編號及采集信息，只在對應編號的食餌臂放置1顆瓜子仁作為食餌，而在其他臂中不做任何處理。每只鼠在實驗結束后用體積分數75%乙醇噴灑擦拭箱體以去除氣味滯留。實驗者輕柔地將大鼠放置于迷宮中央，適應環境30 s后同時打開閘門并開始記錄其自由探究運動軌跡。軟件分析2組大鼠移動距離、移動速度、總體耗時、參考記憶錯誤以及工作記憶錯誤等實驗指標，以評估兩種方法對大鼠空間學習記憶探索能力。工作記憶錯誤(working memory errors)，即在同一次實驗中大鼠再次進入已經吃過食餌的臂; 參考記憶錯誤(reference memory errors), 即在一次實驗中動物進入非食餌臂。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 平均移動距離、探索時間和移動速度

分析第8日采集的視頻軌跡可知，與對照組相比，實驗組完成實驗的平均移動距離和平均探索時間差異有統計學意義(P＜0.01)，而平均移動速度差異無統計學意義(P＞0.05)(表1)，表明本實驗中使用的加熱裝置不會對其運動能力造成影響。

2.2 參考記憶錯誤和工作記憶錯誤百分比

分析2組大鼠第8日采集視頻軌跡可知，與對照組相比，實驗組完成實驗的參考記憶錯誤百分比存在極顯著差異(P＜0.01)且小于15%達到訓練標準。而工作記憶錯誤百分比無顯著差異(P＞0.05)(表2)。

2.3 第7日訓練結果

在訓練第7日，2組大鼠均能在10 min內成功完成探索任務。但對照組大鼠完成探索所需時間明顯長于實驗組。

表1 平均移動距離、探索時間和移動速度

表2 探索過程的參考記憶錯誤和工作記憶錯誤百分比

2.4 運動軌跡圖

通過視頻軌跡跟蹤系統軌跡(圖1)可見，對照組大鼠在傳統方式訓練7 d后無法達到八臂迷宮實驗追蹤測試標準，而實驗組大鼠在改良實驗方法訓練7日后均達到八臂迷宮實驗追蹤測試標準。

圖1 兩組實驗動物運動軌跡圖

3 討論

八臂迷宮又稱放射性迷宮，該裝置已廣泛應用于檢測藥物作用或疾病模型損傷下嚙齒類動物大腦空間學習記憶能力[3]。八臂迷宮實驗準確敏感地反映腦空間學習記憶功能，使其成為檢測嚙齒類動物空間記憶的重要實驗方法之一。空間記憶又分為參考記憶和工作記憶。工作記憶屬于程序性記憶范疇，是在皮層-紋狀體系統調控下完成的對進行中工作任務的重要信息的短期存儲；參考記憶則是空間定位物體本身以及物體與食餌的相對關系[4]。海馬結構在短期記憶向長期記憶轉變和空間學習記憶功能中發揮至關重要作用[5]。

實驗者可通過分析實驗動物運動軌跡參數，客觀反映實驗動物在不同處理條件下特定腦區空間分離記憶能力[6]。然而參考國內外諸多文獻[2,3,11]表明，八臂迷宮實驗操作目前沒有標準統一的工作流程。想要達到最終追蹤測試標準即工作記憶錯誤和參考記憶錯誤均小于15%，通常需要2～4周甚至更長時間。本實驗中，對照組大鼠在訓練7d后雖然能在10 min內完成實驗探索，但參考記憶錯誤(平均值41.56%)遠超15%的要求。證明傳統訓練方式無法在7 d內使大鼠達到最終測試標準。所以非常需要有針對大鼠行為特點的新型訓練設備和相對規范的操作流程。

本實驗創新性采用在無食餌臂增加電加熱設備刺激大鼠足底的改良八臂迷宮實驗方案。并且通過實驗證明相對于傳統方法，此方案能在連續7 d的訓練過程中使大鼠在八臂迷宮中快速準確完成覓食活動。實驗結果對比中表明，兩組大鼠均能對陌生的八臂迷宮環境進行自主探索覓食。在分析覓食策略中發現，應用改良實驗方法在相同訓練時間內能顯著縮短覓食運動平均移動距離和探索時間, 更好體現動物進化中優先選擇食餌策略。分析兩組大鼠平均運動速度可知，改良實驗中60 ℃的足底熱刺激對大鼠運動能力無明顯影響。證明相對于其他水、光、電強刺激, 合理溫度的熱刺激更能降低受試動物的應激概率，以免出現實驗動物因過于恐懼停止探索或強刺激作用下的恐懼情緒對空間記憶形成影響等所致實驗失敗現象[2]。除此之外，與對照組相比，實驗組大鼠參考記憶錯誤百分比有極顯著降低，證明改良實驗方法有利于增強大鼠對食餌臂和非食餌臂空間記憶。有趣的是, 兩組實驗結果中工作記憶錯誤百分比無統計學意義，提示改良實驗方法對實驗動物短時記憶無顯著影響, 再次表明此方案中的熱刺激條件不會造成實驗動物的應激反應。

綜上所述，本實驗采用改良電加熱八臂迷宮設備配合參考諸多國內外權威文獻及多次實驗的改進，形成的實驗操作流程能在訓練7 d后完成檢測大鼠空間學習記憶的八臂迷宮實驗。相比于傳統實驗方法，改良迷宮設備造價低廉，價格優勢明顯，且操作流程簡單易學，并能顯著縮短迷宮訓練周期，為更好評價實驗動物空間分離記憶功能檢測提供新方案。