用吖啶橙-流式細胞儀技術(shù)檢測間苯二胺、對苯二胺誘導(dǎo)的小鼠骨髓細胞微核率

陳秀娟, 江 漪, 李 敏, 李培寧, 孫 俠, 陳梓靈, 丘智峰, 黃宇鋒

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

微核(Micronucleus)也叫衛(wèi)星核，是真核類生物細胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變在間期細胞中的一種表現(xiàn)形式。應(yīng)用小鼠骨髓紅細胞微核試驗 (Micronucleus test)是一種能獲得大量客觀數(shù)據(jù)的遺傳毒性試驗方法之一，該方法簡便、易行、經(jīng)濟, 因而被廣泛采用, 但傳統(tǒng)的微核計數(shù)是實驗人員借助顯微鏡完成的, 方法枯燥、耗時, 易受實驗者主觀因素影響, 而且 Giemsa染色法特異性較差, 非特異著色顆粒有時很難與微核相區(qū)別，影響實驗結(jié)果判斷。近年來流式細胞術(shù)在細胞學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、制藥學(xué)和微生物學(xué)等多個領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[1-4], 本文參照有關(guān)文獻[5-7], 利用小鼠骨髓細胞經(jīng)吖啶橙(acridine orange, AO)熒光染色, 采用單激光流式細胞儀(flow cytometer, FCM)檢測骨髓細胞中含微核的嗜多染紅細胞(micronucleated polychromatic erythrocytes)和含微核的成熟紅細胞(micronucleated normochromatic erythrocytes)，通過與傳統(tǒng) Giemsa人工顯微鏡檢測法(Giemsa人工法)比較，建立AO-FCM自動化微核試驗，探討FCM在化妝品原料致突變性檢測中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級 雌性KM小鼠50只, 體質(zhì)量 20～25 g，由山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[SCXK(魯) 2014-0007]。飼養(yǎng)于本單位屏障環(huán)境動物設(shè)施[SYXK(粵)2014-0137]。實驗小鼠檢疫合格后隨機分組，每組5只。實驗過程中所有動物在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。

1.2 試劑與儀器

間苯二胺(MPD)、對苯二胺(PPD)[3]均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司, 其中PPD規(guī)格： 100 g/瓶，純度＞99%，批號： H1829001, MPD規(guī)格： 100 g/瓶，純度＞99.0%，批號： J1815296。環(huán)磷酰胺 (CP) 和(AO 均購自上海源葉生物科技有限公司; TritonX-100購自美國 Sigma公司; 小牛血清購自美國 Gibco 公司; 0.9%氯化鈉溶液(NS)購自山東化魯制藥有限公司; 其余均為國產(chǎn)市售分析純試劑。

CytoFLEX FCM購自美國 Beckman 公司; Axio Lab A1 顯微鏡購自德國蔡司公司; KDC-1044 低速大容量離心機購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試劑配制

固定液： 十二烷基硫酸鈉(SDS) 3 mg + 0.05 mol/L,pH 6.8 Sorensen's 緩沖液 99 mL + 戊二醛 1 mL。

溶液A： Triton X-100 0.05 mL + 1.0 mol/L HCl 4.0 mL+ NaCl 0.4385 g，加水至 50.0 mL。

溶液B： 0.1 mol/L 檸檬酸溶液 37 mL + 0.2 mol/L Na2HPO4溶液 63 mL + NaCl 0.877 g + EDTA-Na20.034 g + 1 mg/mL AO 0.6 mL。

1.4 藥物處理

受試物劑量組分別以25.0 mg/kg、12.5 mg/kg、6.25 mg/kg和3.12 mg/kg劑量[7]腹腔注射MPD或PPD。陽性對照組腹腔注射40 mg/kg 的CP, 陰性對照組給予同等容量生理鹽水(NS)。注射量均為10 mL/kg, 24 h后以同樣的劑量進行第2次染毒。

1.5 AO-FCM法

于末次染毒 6 h 后處死小鼠，分離雙側(cè)股骨，用注射器吸取400 mL 小牛血清將骨髓沖出，反復(fù)沖洗吹打，制成細胞懸液。取2.5 mL 固定液于離心管中，在振蕩混懸儀下邊振蕩邊加入100 mL細胞懸液，固定5 min，1 250 r/min 離心5 min，去上清，細胞沉淀重新混懸于100 mL 0.06 mol/L、pH 7.2的 Sorensen's 緩沖液中。溶液A與溶液B在使用前置于0 ℃冰箱放置2 h，使溶液保持低溫，加入 200 mL 溶液A與 800 mL 溶液 B，混勻，置于冰上避光染色 30 min。1 250 r/min 離心 5 min，去上清，細胞沉淀重新混懸于2.5 mL 0.06 mol/L、pH 7.2 Sorensen's 緩沖液中，用FCM進行測定。

FCM 的主要參數(shù)： 前置角(0°)散射光(FSC)，側(cè)向角(90°)散射光(SSC)。DNA 熒光(FL1，綠色,525 nm)，刻度設(shè)置為對數(shù); RNA熒光(L4，紅色，675 nm), 刻度設(shè)置為線性。采集速度控制在1 500± 500個細胞/秒。每個樣本采集200 000個細胞進行分析。利用 FCM自帶軟件CytExpert 2.2 的分區(qū)功能, 去除有核細胞(Nucleated cells, NC), 把 PCE、MNPCE、成熟紅細胞(NCE)、MNNCE 劃分為4個區(qū), 計算骨髓嗜多染紅細胞微核率(fNMPCE)、骨髓成熟紅細胞微核率 (fMNNCE)、PCE/NCE。

1.6 Giemsa 人工法

對傳統(tǒng)的 Giemsa 染色法進行了適當(dāng)?shù)母倪M： 把上述剩余的骨髓細胞懸液以 1 000 r/min 離心 5 min，去上清，細胞沉淀重新混懸于40 mL 血清中，取15 mL 制成骨髓細胞涂片, 涼干后, 甲醇固定 15 min,以 pH 6.8 Sorensen's 緩沖液配成濃度為 10% 的Giemsa染液，常溫下染色 40 min，用純凈水沖洗，再用 0.004 % 檸檬酸潤洗數(shù)秒后, 馬上用純凈水沖洗，涼干，用環(huán)保封片劑進行封片，鏡檢。每只小鼠分別記數(shù) 1000個PCE，計數(shù)MNPCE，計算 fMNPCE ，以千分率表示。同時計數(shù) 200個PCE時所見的NCE數(shù)，計算 PCE/NCE。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 AO-FCM 法檢測小鼠骨髓 fMNPCE、fMNNCE、PCE/NCE

用FCM前置角散射光(Forward angle scatter，F(xiàn)SC) 和 DNA 熒光(DNA fluorescence，F(xiàn)L1) 作二維散點圖，可以明顯看到細胞樣本區(qū)分為5 個群：NC(P1)、PCE(P2)、MNPCE(P3)、NCE(P4)、MNNCE(P5)。NC與紅細胞分界清楚，PCE與NCE分界也較為清楚，PCE與MNPCE、NCE與MNNCE的分區(qū)有明顯的分界趨勢。與陰性對照組比較，CP處理組的有核細胞密度下降，MNPCE及MNNCE 區(qū)域的細胞密度明顯增加，而陰性對照組的MNPCE及MNNCE所在區(qū)域未見明顯的細胞群。CP處理組與陰性對照組比較，fMNPCE、fMNNCE升高有顯著性差異 (P＜0.01)。MPD和PPD各劑量的 MNPCE 及 MNNCE 區(qū)域的細胞密度明顯增加，而且細胞密度隨著濃度的加大而增加，有劑量-反應(yīng)關(guān)系(圖1)。且MPD和PPD各劑量的 fMNPCE、fMNNCE與陰性對照組比較有顯著升高(P＜0.01)。PCE/NCE＞1.0，顯示MPD和PPD未對小鼠骨髓有抑制作用(PCE/NCE＞1.0)(表1)。

2.2 Giemsa人工法 檢測小鼠骨髓 fMNPCE、fMNNCE

細胞涂片 Giemsa 染色后，經(jīng) 0.004 % 檸檬酸潤洗數(shù)秒，在顯微鏡下觀察，PCE為灰藍色，NCE呈淡黃或橘黃等鮮艷明亮的顏色，MN呈圓形或橢圓形，邊緣光滑整齊，呈紫紅色或藍紫色。玻片的背景清楚，PCE與 NCE有明顯的顏色差別，易于辨認。MPD和PPD各劑量的 fMNPCEE、fMNNCE 有明顯有升高，與陰性對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。PCE/NCE＞1.0，顯示MPD和PPD未對小鼠骨髓有抑制作用(表2)。

2.3 AO-FCM 法與 Giemsa 人工法檢測小鼠骨髓微核結(jié)果的比較

分析比較兩種方法的fMNPCE, 無論是AO-FCM法還是 Giemsa人工法均顯示MPD、PPD誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的升高, 結(jié)果一致。AO-FCM法檢測結(jié)果略高于Giemsa人工法檢測結(jié)果，但經(jīng)SPSS 22 .0分析顯示，二者間具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為r =0.956, P＜0.01[10]。

表1 用 AO-FCM 法檢測小鼠骨髓的 fMNPCE、fMNNCE、PCE/NCE

圖1 小鼠骨髓細胞群在FCM檢測窗口的分布圖

表2 用 Giemsa 人工法檢測小鼠的骨髓 fMNPCE, PCE/NCE

3 討論

苯胺類物質(zhì)作為氧化型染發(fā)劑中最常見的染料，其中常用的MPD和PPD 均會對人體產(chǎn)生一定的危害[10-12]，是國際公認的一種致癌物質(zhì)[13]。

隨著FCM檢測技術(shù)的完善，流式細胞術(shù)在微核試驗的檢測方面有了長足的進步。國內(nèi)外研究報道，目前已建立了大鼠、小鼠的骨髓嗜多染紅細胞微核的FCM檢測方法。本實驗在以往文獻報道的研究基礎(chǔ)上，用AO染色，采用單激光FCM檢測了小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率，探討此方法用于化妝品原料的遺傳毒性篩選和遺傳毒性評價的可能性。經(jīng) AO染色，PCE含RNA被染成橘紅色，含DNA的細胞核及微核被染成黃綠色，而 NCE不含DNA也不含RNA，不被染色，所以顯示為暗影。理論上，可利用FL1(黃綠色熒光，指示 DNA)或者 FL4 (紅色熒光，指示RNA)區(qū)分PCE與NCE。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)L4不能把PCE與NCE區(qū)分開，而FL1 則能很好地對其進行區(qū)分，但 FL1不能把含微核的細胞與不含微核的細胞區(qū)分出來，本實驗利用FL1 結(jié)合 FSC (指示細胞大小)，則能把細胞樣本區(qū)分為5個群： NC、PCE、MNPCE、NCE、MNNCE。本實驗結(jié)果顯示： FCM在檢測fMNPCE的同時可檢測fMNNCE，從FCM檢測窗口的分布圖可見 MNNCE 區(qū)域的細胞密度，隨著劑量升高也有不同程度的增加，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系。fMNNCE是否也可能作為監(jiān)測遺傳損害的生物學(xué)指標(biāo)之一呢？非常值得今后更進一步深入研究。

本實驗采用AO-FCM法檢測出的小鼠骨髓fMNPCE稍高于 Giemsa 染色人工顯微鏡檢測值。初步分析原因如下： ①可能是個別紅細胞產(chǎn)生了較強的自發(fā)熒光，造成結(jié)果偏高; ②可能是部分體積較大的PCE被誤認為含微核的PCE，而導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn); ③可能是 Giemsa人工法只計數(shù)1 000個PCE，樣本量少而容易出現(xiàn)漏判，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。雖然用AO-FCM檢測存在有假陽性的可能，但流式細胞術(shù)檢測的細胞數(shù)是幾十萬個甚至是更多的細胞，Giemsa人工法一般只是計數(shù)1000至2000個PCE，流式細胞術(shù)檢測細胞數(shù)量巨大，對最終檢測結(jié)果的影響仍是有限的。Giemsa人工法中，實驗人員在顯微鏡中依靠細胞顯示的染色判別 PCE、NCE、MNPCE和MNNCE，理論上PCE呈灰藍色，NCE呈桔紅色，MN呈紫紅色，但是 Giemsa 復(fù)合染料中往往含有嗜天青顆粒，很難與MN區(qū)別，而且 PCE與 NCE細胞之間并沒有明顯的區(qū)分界限，顯微鏡下仍難以將兩者完全區(qū)分; 同時不同的實驗人員或不同的實驗室之間并無一致的評判標(biāo)準，這些因素都會影響結(jié)果的判斷。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明 AO-FCM自動化微核檢測體系可替代人工顯微鏡，用于小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的檢測。