循環內皮微粒相關microRNA在巨噬細胞炎性反應誘發小鼠動脈粥樣硬化發生的機制

孫理華, 張 穎, 曹桂秋, 李 鵬, 胡 強, 張雅玲, 幸世峰

(新疆醫科大學第五附屬醫院心血管內科, 烏魯木齊 830011)

心血管疾病是世界范圍內導致患者死亡的主要原因，而動脈粥樣硬化(AS)性炎癥是心血管疾病和進一步急性并發癥的主要因素[1-3]，AS影響大動脈和中動脈的內膜，特別是在動脈分支部位。炎癥反應的作用是心血管疾病研究的重要內容，目前許多心血管疾病的治療方法,包括他汀類藥物和血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑，都與抗炎特性有關[4,5]。細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細胞粘附分子(VCAM-1)，吸引淋巴細胞和單核細胞與內皮結合并浸潤動脈壁內膜介質層,經修飾的低密度脂蛋白(LDL)，如氧化的LDL(oxLDL),被證明能刺激促進炎癥的產生,加速AS斑塊的形成[6]。在內膜中單核細胞會向吞噬oxLDL沉積物的巨噬細胞分化，因膽固醇流出物和oxLDL清除功能受損[7]，樹突狀細胞(dc)、中性粒細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞(NK)細胞等免疫細胞也參與細胞內炎癥的反應[8]。所以，單核細胞和T細胞在AS發病機制中的重要作用得到廣泛認識和研究。Zernecke等[9]研究指出,由于動脈區域受到異常剪切應力，導致內皮微粒(EMPs)的促炎癥激活，EMPs內存在內源性的非編碼MicroRNAs(miRNAs), 在細胞間起著重要作用。有研究表明，冠狀動脈疾病患者的循環miR-19b水平明顯高于陰性對照組患者, 而miR-19b主要存在于EMPs中[10-12]。EMPs是miR-19b在血管內皮細胞和其他細胞之間的通信中的重要載體，然而miR-19b對AS進展的影響尚不清楚，因此該研究主要探討miR-19b在AS中對炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性ApoE-/-小鼠, 5周齡, 體質量15～20 g,共206只，實驗組156只，對照組50只，均購自南京天邦生物科技有限公司[SCXK(蘇)2015-0018]，在SPF條件下飼養[SYXK(新)2018-0003]。所有的實驗動物程序都符合動物管理和使用委員會的審查和批準。

1.2 儀器與試劑

EzRIPA裂解試劑盒(ATTO,Tokyo,日本); 線粒體分離試劑盒(BioChain Institute Inc., Gibbstown, NJ,美國); Pierce BCA Protein Assay Reagent試劑盒、DAB顯色試劑盒(邁新生物技術有限公司); miR-19b特異性逆轉錄引物及逆轉錄試劑盒(上海生工工程有限公司); 水合氯醛(北京百順化學科技有限公司); 甲醛、異丙醇和氨水(無錫市亞泰聯合化工有限公司);蘇木素(北京索萊寶科技有限公司)，Immobilon-P Transfer Membran過濾器(Millipore Co., Bedford, MA,美國); 離心機(上海安亭離心機廠); 羅氏全自動免疫組化儀(上海羅氏制藥有限公司; 酶標儀(美國Bio-Tek公司); PCR儀(賽飛中國有限公司)。

1.3 建立AS小鼠模型和分組

實驗組ApoE-/-小鼠156只隨機分為3組，患有AS模型組，NC-miRNA組及miRNA-19b抑制劑組,每組52只。對照組小鼠給予正常飲食飲水飼養。實驗組3組行AS造模，喂脂膽固醇飲食(1.25%膽固醇和21%脂肪), 8周后, 3組中分別隨機解剖小鼠2只, 3 000 r/min離心10 min, 檢測血脂水平，取小鼠主動脈, HE染色觀察主動脈組織結構, 確認造模成功。NC-miRNA組造模成功后尾靜脈注射miRNA抑制劑構建AS模型小鼠為陰性對照;miRNA-19抑制組組構建AS小鼠模型后尾靜脈注射miRNA-19b抑制劑，80 mg/kg，1次/d，連續注射3 d。摘眼球取血，腹腔注射質量分數10%水合氯醛，處死后解剖取胸主動脈，置于質量分數4%多聚甲醛溶液中固定，進行病理染色，部分放于-80℃凍存，備用。

1.4 觀測指標及方法

1.4.1 AS病變的組織學評價 將主動脈組織固定后進行梯度蔗糖脫水, 組織沉底后取出, 投入包埋劑中浸泡使氣泡排盡，包埋，-20℃恒溫環境下進行冰凍切片, 體積分數60%異丙醇浸泡，油紅染色液浸染, 蘇木素復染, 氨水返藍后甘油封片。在光學顯微鏡下對組織進行觀察，將測量出的斑塊面積除以計算所得的主動脈面積, 則得出斑塊面積百分，并對各組的斑塊面積百分比進行統計、比較分析。

1.4.2 小鼠血脂水平檢測 取眼球血分離血清(離心條件3 000 r/min 10 min)，檢測血清中膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)指標。

1.4.3 ELISA血管炎癥性因子濃度檢測 BCA法測定提取的蛋白濃度。按照試劑盒說明書進行腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、IL-6和IL-10檢測，然后用酶標儀檢測各孔的吸光度(A)值。EzRIPA裂解試劑盒裂解細胞, 使用線粒體分離試劑盒分離線粒體, 均按照制造商的說明書進行操作。使用Pierce BCA Protein Assay Reagent試劑盒測定蛋白質濃度。在Laemmli樣品緩沖液中裂解蛋白質, 進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳, 并轉移到Immobilon-P Transfer Membrane過濾器上。

1.4.4 Western blot檢測小鼠血管組織中相關蛋白表達變化 取適量動脈組織樣品置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，組織塊盡量剪碎后加400 μL單去污劑裂解液[含苯甲基磺酰氟(PMSF)]進行勻漿，重復幾次使組織盡量破碎。裂解30 min后, 在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清進行BCA檢測蛋白濃度; 加入一抗(1∶200)，搖床震蕩2 h; 用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min; 再用TBS洗一次，10 min，二抗孵育2 h, 用0.01mol/L PBS洗膜3次，電化學發光(ECL)底物發光表示蛋白的相對表達量。

1.4.5 實時熒光定量PCR檢測miR-19b表達及細胞凋亡實驗 取液氮保存中的主動脈組織于預冷研缽內，使其一直處于液氮中研磨，最后用勺子收集粉末, 放入含1 mL trizol的1.5 mL無酶離心管中, 混勻測定總RNA濃度及純度，采用miR-19b特異性逆轉錄引物及逆轉錄試劑盒合成cDNA(上海生工工程有限公司)，隨后以cDNA為模版進行熒光定量PCR反應，PCR儀設置條件為37 ℃保持15 min、85℃保持5 s、4℃至最終。取各組動脈組織檢測細胞的凋亡情況，根據Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒進行檢測。

1.5 統計數據

2 結果

2.1 AS病變的組織學比較

如圖1所示，對照組小鼠內皮細胞排列整齊(圖1A)，AS組和NC-miRNA 組小鼠血管內皮細胞的排列較亂, 內膜厚度增加(圖1B、C), miRNA-19b抑制劑組小鼠組織病變程度大大減輕(圖1D)。小鼠的主動脈斑塊面積百分比比較分析表明，對照組小鼠主動脈檢測出粥樣斑塊為無，其它各組小鼠主動脈粥樣斑塊面積百分比大小順序分別為：AS模型組＞NC-miRNA 組＞miRNA-19b 抑制劑組(表1)。miRNA-19b抑制劑組顯著高于對照組，但顯著低于模型組與 NC-miRNA 組 (P＜0.05)。

2.2 血脂相關指標

與對照組比較，AS模型組、NC-miRNA組及miRNA-19b抑制劑組TC、TG和LDL-C 水平明顯升高, 而HDL-C水平含量降低; 與模型組和NC-miRNA組比較, miRNA-19b抑制劑組TC、TG和LDL-C水平降低, HDL-C 水平則有升高 (P＜0.05)(表2)。

2.3 血管炎癥性因子的表達水平

圖1 各組小鼠動脈血管組織病理變化 (Oil-red染色×600)

表1 各組小鼠胸腔動脈斑塊面積百分比

如表2所示, AS模型組與對照組相比，IL-1、IL-6和TNF-α的水平升高，而 IL-10水平則有比較明顯降低; NC-miRNA 組各指標也有相同的變化趨勢; miRNA-19b抑制劑組IL-1、IL-6和TNF-α水平低于AS模型組和NC-miRNA 組，IL-10的水平則高于兩組(P＜0.05)。

2.4 血管組織中凋亡因子Bcl-2 cleaved-PARP和Bax的表達水平

如表4、圖2所示, 與對照組比較, NC-miRNA、AS模型組的Bax和cleaved-PARP 表達量升高，但Bcl-2表達水平下調(P＜0.05)。與模型組和NC-miRNA組相比，miRNA-19b抑制劑組的促細胞凋亡的蛋白Bax和cleaved-PARP表達水平下調，Bcl-2的表達水平上調。

表2 各組小鼠血脂相關性指標比較 mmol/L

表3 各組小鼠血清IL-1、IL-6、IL-10和 TNF-α含量比較 g/L

表4 各組小鼠BCL-2、cleaved-PARP和Bax的蛋白相對表達量

圖2 Western blot檢測各組BCL-2、cleaved-PARP和Bax蛋白表達

2.5 miRNA-19b的表達

如表5和圖3所示，與對照組比較，AS模型組(2.71±0.02)和NC-miRNA 組(2.43±0.02)d的miRNA-19b的蛋白表達明顯增加 (P＜0.05); 與AS模型組和NC-miRNA 組比較，miRNA-19b抑制劑組(1.52±0.01)蛋白表達顯著下降 (P＜0.05)。

表5 各組小鼠miRNA-19b表達量比較

圖3 Western blot檢測各組miRNA-19b表達

2.6 各組巨噬細胞的凋亡率檢測結果

與對照組比較，AS模型組、NC-miRNA組及miRNA-19b抑制劑組細胞凋亡率均升高 (P＜0.05); 與AS模型組和NC-miRNA組比較，miRNA-19b抑制劑組細胞凋亡率顯著降低 (P＜0.05)(表6和圖4)。

表6 各組巨噬細胞的凋亡率檢測結果比較

3 討論

在AS進程中，免疫和非免疫的血管細胞會釋放多種促炎信使，包括細胞因子、趨化因子、生物活性脂類化合物和粘附分子，這些分子可以維持和增強局部炎癥和AS病變的發展[11]。AS是一種慢性疾病，導致心力衰竭和死亡的最主要原因，AS

圖4 流式細胞儀檢測各組巨噬細胞凋亡率

的病理生理機制包括脂質代謝紊亂、慢性炎癥血管和血細胞中促炎信號通路的上調促進了AS的發生,炎癥在AS所有階段的重要作用目前已為人所知, 目前研究主要關注一些關鍵的促炎調節劑在AS過程中的作用，如IL-1、IL- 6、TNF-α和IFN-γ等關鍵因素促炎細胞因子[12]。Qamar等[13]在臨床研究中發現, IL-1在抑制治療慢性炎性疾病方面有效果,暗示IL-1作為抗炎治療AS的目標, 炎癥涉及多種難以靶向治療的調節和補償機制, 抑制這些細胞因子的過度血管生成可能對抗炎治療AS具有重要意義。

本研究表明，抑制miRNA-19b能夠較明顯改善內皮細胞損傷，緩解由于AS引起的血管厚度增加，減少AS斑塊的面積比例。與本文結果類似，Souilhol 等[14]研究同樣表明，miRNA-19b與AS發展具有相關性，miRNA-19b抑制劑組血脂指標TC、TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平則有升高，可以解釋抑制小鼠體內的miRNA-19b可以緩解AS。研究[15]表明，miRNA-19b能夠減少吞噬免疫細胞的凋亡率，相關蛋白的表達量變化檢測亦支持該結果。miRNA-19b經抑制后，作為細胞凋亡的標志蛋白Bax和cleaved-PARP的表達量下降, 同時具有抑制細胞凋亡作用的相關蛋白Bcl-2的表達量上升。Naugler等[16]研究表明，IL-6是急性炎癥的關鍵介質, 可視為炎性生物標志物, IL-6是由巨噬細胞和T細胞在感染或損傷后的最初階段產生, 以誘導免疫反應和炎癥，血管平滑肌細胞也會分泌IL-6來應對炎癥刺激和損傷，因為這種細胞因子是這種細胞類型的有絲分裂因子, IL-1產生的促炎癥細胞因子[17], 廣泛激活巨噬細胞。Canakinumab等[18]對人類特異性IL-1β單克隆抗體初步臨床試驗結果顯示，IL-1在急性心肌梗死、中風和AS等疾病中的療效。TNF-α是一個有效的促炎細胞因子，主要在巨噬細胞和參與系統性炎癥和傳播的急性期反應[19,20]，TNF-α有不同的免疫調節功能，如抑制病毒復制和致癌作用, 誘導細胞凋亡和炎癥，啟動防御反應應對膿毒癥等等[21]，生產過剩的TNF-α與急性和慢性炎癥有關，會對免疫介導的組織產生破壞，因此抑制這些細胞因子的過度血管生成可能對抗炎治療AS具有重要的治療意義。本研究結果中通過抑制miRNA-19導致IL-1、IL-6和TNF-α水平降低，IL-10的水平升高, 表明抑制miRNA-19b可以下調促炎因子，同時上調抗炎因子表達，減輕AS小鼠動脈血管組織中的炎癥反應。Sun等[22]認為，抑制miRNA-19b可調節巨噬細胞的增殖凋亡，從而抑制AS的發展進程。miRNA-19b微粒廣泛存在于血液、組織和細胞中，與機體多種病理生理過程有關。miRNAs是一種內源性的、長度為19～25個核苷酸的非編碼RNA，在細胞間的相互作用中起著至關重要的作用，關于miRNAs的研究已經成為生命科學領域研究的熱點，miRNAs與人類多種疾病密切相關。

綜上所述, 循環EMPs相關miRNA-19b的存在可以減少巨噬細胞的凋亡, 并且通過上調促炎因子促進組織周圍炎癥的發生, 進而促進AS的發展進程。