Myh13敲除小鼠表型的初步分析

何一旻, 顧鳴敏

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200025)

肌球蛋白超家族(myosin superfamily)是一類高度保守且廣泛存在于真核細(xì)胞中的家族蛋白，通過水解三磷酸腺苷(ATP)，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，在胞質(zhì)流動、物質(zhì)運(yùn)輸和肌肉收縮等多種生理活動中發(fā)揮重要的作用。在該蛋白家族中, 肌球蛋白II類是橫紋肌、平滑肌和非肌細(xì)胞中肌絲的重要組成成分[1]。肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)是肌球蛋白II類分子的關(guān)鍵亞基。迄今為止，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)約13種MyHC亞型，分別由MYH家族基因不同成員編碼。其中，編碼骨骼肌MyHC亞型的有6種，MYH13基因?yàn)槠渲兄籟2]。

小鼠Myh13基因定位于第11號染色體，由39個外顯子組成, 開放閱讀框全長5 817 bp，編碼產(chǎn)物為MyHC-eo亞型, 由1933個氨基酸組成。MyHC-eo蛋白序列在不同種屬之間高度保守，經(jīng)比對，小鼠的MyHC-eo蛋白序列與人MyHC-eo蛋白序列相似度約為96%。在生理狀態(tài)下, MyHC-eo與其他MyHC亞型一樣，由2條MyHC和2對不同的輕鏈組成一個完整的肌球蛋白分子。MyHC蛋白包含2個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域： N端的頭部結(jié)構(gòu)域，含肌動蛋白和ATP結(jié)合位點(diǎn)，即所謂的橫橋; C端的桿狀結(jié)構(gòu)域，參與粗肌絲的形成[3]。

在人類中，MyHC-eo特異性高表達(dá)于眼外肌(extraocular muscle, EOM)纖維中[4]，為一類具有超高速率、低張力、耐疲勞特點(diǎn)的肌纖維[5]。體外研究[6]結(jié)果表明, 在橫橋周期動態(tài)變化過程中, 與其他骨骼肌中的MyHC IIa、MyHC IIb和MyHC IIx亞型相比, MyHC-eo結(jié)合肌動蛋白后與二磷酸腺苷(ADP)的親和力最低，與肌動蛋白的結(jié)合和解離速率最快，橫橋周期最短，導(dǎo)致肌肉收縮超快。然而，迄今為止，仍缺乏解釋MyHC-eo與眼外肌超高速率、低張力、耐疲勞特點(diǎn)相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，更不清楚MYH13在眼外肌纖維中所發(fā)揮的生物學(xué)作用。

本研究首先分析了Myh13在小鼠中的表達(dá)情況，證明在小鼠中Myh13同樣特異性高表達(dá)于眼外肌中。隨后，對Myh13敲除小鼠進(jìn)行表型初步分析。結(jié)果顯示，Myh13的敲除對小鼠的生長發(fā)育、基礎(chǔ)代謝等沒有明顯影響，但會引起小鼠眼外肌纖維微觀結(jié)構(gòu)的改變，為后續(xù)研究MYH13在眼外肌中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立的Myh13敲除小鼠，該工作由上海南方模式生物科技有限公司完成，所用小鼠品系為C57BL/6J[SCXK(滬)2017-0010]。所得小鼠后續(xù)均飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，該環(huán)境維持恒溫(21～22 ℃)恒濕(55%～65%)，光照明暗交替12 h/d[SYXK(滬)2017-0012]。

1.2 主要儀器與試劑

基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、動物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Quantscript RT試劑盒、qPCR試劑盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)均購自天根生化科技有限公司; 引物由金唯智生物科技有限公司合成; 蛋白抽提試劑RIPA裂解液(強(qiáng))和蛋白酶抑制劑Cocktail購自翊圣生物科技有限公司; MyHC-eo抗體由上海友科生物科技公司制備; GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗均購自美國Proteintech公司; ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。實(shí)時熒光定量PCR分析儀ABI 7500 購自美國Biosystems公司; Western blotting 專用電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽和變壓器購自美國Bio-Rad 公司; 化學(xué)發(fā)光信號檢測儀Lumi-Phos購自美國Thermo Fisher公司; 梯度PCR擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司; 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)和光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司; 透射電子顯微鏡超薄樣本切片機(jī)購自德國Leica公司; 透射電子顯微鏡購自日本Hitachi公司。

1.3 Myh13在不同組織中的表達(dá)情況

取8周齡的野生型C57BL/6J小鼠(WT)，分別取眼球、肝臟、腎臟、脾臟、胃、腸、睪丸等14種器官和血液，以及眼外肌、咀嚼肌、膈肌、腹直肌等8種不同部位肌組織，分別使用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物Myh13-F和Myh13-R(引物序列見表1)，以Gapdh(引物見表1)為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR檢測Myh13 mRNA在小鼠各組織中的表達(dá)情況。同時提取各組織的蛋白成分，采用Western blotting法檢測MyHC-eo蛋白在小鼠各組織中的表達(dá)情況。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 gRNA設(shè)計(jì)

gRNA靶基因設(shè)計(jì)原則： ①靶序列20 bp后含NGG模式的PAM序列; ②靶序列在基因組水平具有高度唯一性, 以避免脫靶效應(yīng)。后利用網(wǎng)站(http：//crispr.mit.edu)設(shè)計(jì) gRNA，用于CRISPR/Cas9構(gòu)建Myh13敲除小鼠。經(jīng)篩選，選擇兩條分別在Myh13的第2外顯子上游和第3外顯子下游的gRNA，序列和位置分別為：

gDNA1(1670-1692)： 5'-CTAGAATCAGGTTAACCAAGGGG -3';

gDNA2(2317-2339)： 5'-AGTAGCAGCCAGCATGAACTTGG-3'。

1.5 Myh13敲除小鼠基因型鑒定

小鼠3周齡時，提取鼠尾基因組DNA。對于F0代小鼠使用引物P1和P2(引物序列見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P1和P2分別位于敲除片段前后。PCR產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序以篩選Myh13移碼突變的小鼠。對后續(xù)子代小鼠使用引物對P3和P4、P5和P6分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)。P3是位于靶基因敲除片段上游的正向引物，P4是敲除片段中的反向引物。P5同樣是位于靶基因敲除片段上游的正向引物，P6是敲除片段下游的反向引物。反應(yīng)體系：10 μL Taq DNA聚合酶、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、1 μL DNA模板、8 μL去離子水。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性 5 min; 95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證

選取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠，根據(jù)Stuelsatz等[7]描述的方法分離眼外肌組織，提取組織總RNA, 反轉(zhuǎn)成cDNA, 以Gapdh為內(nèi)參，利用引物Myh13-F和Myh13-R(引物序列見表1), 根據(jù)試劑盒SuperReal PreMix Plus要求，采用qRT-PCR法檢測各基因型小鼠眼外肌中Myh13 mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)體系如下： 10 μL SuperReal PreMix、1 μL cDNA模板、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物和8 μL無核酸酶去離子水。定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸32 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。結(jié)果采用2-△△Ct法分析。

1.7 Western blotting驗(yàn)證

選取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠，使用含有蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA強(qiáng)裂解液提取3種基因型小鼠眼外肌中的蛋白，并用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度，隨后加入5×上樣緩沖液，100℃沸水中煮15 min, 使蛋白充分變性。隨后通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，再轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素(NC)膜, 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%奶粉的封閉液室溫封閉1 h, 加入一抗(MyHC-eo抗體或GAPDH抗體) 4 ℃孵育過夜，TBST洗3次,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h, TBST洗3次。最后，經(jīng)ECL顯影液在化學(xué)發(fā)光儀中顯影成像，分析MyHC-eo蛋白的表達(dá)情況。

1.8 Myh13敲除小鼠繁殖情況

統(tǒng)計(jì)Myh13+/-小鼠自交繁育的子代3種基因型小鼠存活的個體數(shù)量, 分析各基因型WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠數(shù)量是否符合1∶2∶1的比例，進(jìn)行孟德爾遺傳分析; 統(tǒng)計(jì)子代中不同基因型小鼠中各性別的數(shù)量; 分析出生性別比例是否存在偏差。

1.9 Myh13敲除小鼠體質(zhì)量監(jiān)測和血生化檢測

取WT、Myh13+/-和Myh13-/-雄鼠各10只，雌鼠各10只，正常飲食喂養(yǎng)，在4～12周齡期間每周稱量一次小鼠體質(zhì)量，并做體質(zhì)量變化曲線圖。取8周齡雄性WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各6只,空腹12h后, 摘取眼球血, 室溫靜置30 min, 離心收集血清，采用希森美康(Sysmex) BX3010檢測血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCHO)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)。

1.10 Myh13敲除小鼠眼外肌H&E染色

選取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各3只, 提取眼外肌組織, 用PBS清洗后于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h, 低濃度至高濃度乙醇脫水, 二甲苯處理后石蠟包埋, 采用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片。對切片進(jìn)行HE染色, 用中性樹膠封固, 于顯微鏡下觀察各基因型小鼠眼外肌病理學(xué)形態(tài)，并采用CellSens Entry圖像分析軟件測量高倍鏡下眼外肌眶層(orbital layer)和球?qū)?global layer)肌纖維橫截面積。

1.11 Myh13敲除小鼠眼外肌透射電鏡觀察

在無菌條件下取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各3只，提取眼外肌組織，后立即置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛中固定24 h, 隨后取出組織塊, 用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗后，10 mg/L鋨酸固定1.5 h，經(jīng)生理鹽水徹底沖洗干凈后進(jìn)行乙醇梯度脫水，再轉(zhuǎn)入丙酮中，包埋，制作超薄切片，飽和醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)(Chi-square test)或單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Myh13的表達(dá)水平

結(jié)果表明，Myh13特異性高表達(dá)于眼外肌中,而在眼球、肝臟、腎臟、脾臟和胃等各個器官中未檢測到表達(dá)(圖1A和1B)，在咀嚼肌和腹直肌等其他肌肉組織中也未檢測到表達(dá)(圖1C和1D)。

2.2 Myh13敲除小鼠DNA、RNA和蛋白水平驗(yàn)證

圖1 小鼠Myh13在不同組織中的表達(dá)水平Figure 1 Expression of Myh13 in different tissues of mice

Myh13敲除小鼠中，純合移碼突變的F0代小鼠原始測序序列為： CGTCCCTTGACTTTAGC——ATGAACTTGGGAGC，與WT小鼠序列比對，刪除769bp。子代小鼠的基因型鑒定顯示, 在WT小鼠中, 僅擴(kuò)增出361 bp未敲除的基因片段; Myh13-/-小鼠中, 僅擴(kuò)增出270 bp的切除后基因片段。在Myh13+/-小鼠中, 均可見上述兩個位置的條帶(圖2A)。與WT相比，Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13 mRNA表達(dá)減少，Myh13-/-小鼠眼外肌中Myh13 mRNA不表達(dá)(圖2B)。并且，Myh13+/-小鼠眼外肌中，MyHC-eo蛋白表達(dá)下降，Myh13-/-小鼠眼外肌中幾乎檢測不到MyHC-eo蛋白的表達(dá)(圖2C)。以上結(jié)果表明，Myh13敲除小鼠中該基因成功剔除，可用于后續(xù)分析。

2.3 Myh13敲除小鼠繁殖情況

結(jié)果表明, 雜合子小鼠的子代中WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠占總體比例分別為23.9%、50.5%和25.7%，接近1∶2∶1，符合孟德爾遺傳規(guī)律，說明Myh13的敲除并不會影響胚胎發(fā)育，也不會導(dǎo)致胚胎致死的現(xiàn)象發(fā)生(表2)。各個基因型小鼠的性別比接近1∶1, 無明顯的性別偏移現(xiàn)象(表3)。

2.4 Myh13敲除小鼠體質(zhì)量及血清生化檢測

WT、Myh13+/-和Myh13-/-三種基因型小鼠體質(zhì)量變化曲線圖顯示，雌性小鼠和雄性小鼠的體質(zhì)量在不同基因型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。同時，也未檢測到8周齡小鼠的空腹血糖、血脂等血清生化指標(biāo)存在明顯異常(表4)。上述結(jié)果提示，Myh13基因敲除對于小鼠的基礎(chǔ)代謝、肝功能、腎功能和心臟功能均沒有明顯影響。

2.5 Myh13敲除小鼠眼外肌H&E染色分析及電子顯微鏡觀察

光鏡下，Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的眼外肌中未見明顯的病理改變，無結(jié)締組織或脂肪組織增加的現(xiàn)象, 也無炎癥或肌肉萎縮的現(xiàn)象(圖4A)。經(jīng)計(jì)數(shù), WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠眼外肌眶層肌纖維數(shù)量分別為(526±49)條、(515±44)條和(519±50)條; 眼外肌球?qū)蛹±w維數(shù)量分別為(348±29)條、(339±43)條和(356±36)條; 眼外肌眶層橫截面積分別為(183.04 ±23.15) μm2、(187.10 ±25.76)μm2和(179.67±23.36) μm2; 眼外肌球?qū)訖M截面積分別為(374.34 ± 38.00) μm2、 (390.51 ± 35.41) μm2和(387.91±34.87) μm2, 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。電子顯微鏡下，三種基因型小鼠眼外肌纖維的細(xì)胞膜完整，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，線粒體和細(xì)胞核正常。但與WT小鼠相比，Myh13+/-眼外肌中可見散在脂滴沉積，Myh13-/-可同時觀察到散在脂滴沉積和肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的現(xiàn)象(圖4B)。由此提示，Myh13的敲除對小鼠的眼外肌雖然并不會引起光學(xué)顯微鏡下的病理變化，但是會影響肌纖維內(nèi)部的超微觀結(jié)構(gòu)，可能會對小鼠的眼外肌功能產(chǎn)生影響。

圖2 Myh13敲除小鼠的基因型鑒定及其眼外肌中Myh13的表達(dá)水平Figure 2 Genotype identification of Myh13 knockout mouse and the expression of Myh13 gene in extraocular muscles

表2 雜合子小鼠自交產(chǎn)生的子代各基因型數(shù)量Table 2 Genotypic ratio in the offsprings from the self-cross of heterozygotes

表3 子代3種基因型小鼠的性別比Table 3 Analysis of sex ratio in three genotypes of offsprings

圖3 三種基因型雄鼠和雌鼠的體質(zhì)量比較Figure 3 Comparison of body weight among three genotypes of male and female mice

表4 三種基因型小鼠血清生化檢測Table 4 Serum biochemical analysis in three genotypes of mice

圖4 三種基因型小鼠眼外肌HE染色和電鏡觀察Figure 4 HE staining and electron microscopic observation for extraocular muscles from mice with three genotypes

3 討論

人類MYH13定位于17p13.1，與MYH1、MYH2、MYH3、MYH4和MYH8相鄰。但是，MYH13與位于同一基因簇的其他MYH有兩點(diǎn)不同：MYH13的全長約為64 kb, 是其他MYH基因的2倍;MYH13中外顯子的分布和其他MYH中外顯子的分布沒有相似性[8]。然而，該基因所發(fā)揮的生物學(xué)功能與MYH家族其他成員相比有何特殊性尚不清楚，并且，MYH13與眼外肌超高速率、低張力、耐疲勞特點(diǎn)的相關(guān)性尚不明確。

本研究中，在WT小鼠中檢測了Myh13在不同組織中的表達(dá)水平，小鼠中Myh13特異性高表達(dá)于眼外肌中，與該基因在人類各個組織中的表達(dá)譜一致。經(jīng)驗(yàn)證， Myh13敲除小鼠的目的基因發(fā)生移碼突變，實(shí)現(xiàn)了基因組水平的基因剔除。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13表達(dá)減少，Myh13-/-小鼠眼外肌中Myh13不表達(dá)。至此說明, 可利用該Myh13敲除小鼠研究人類MYH13的生物學(xué)功能。

與MYH家族相關(guān)的整體動物研究[9]表明，MYH多個成員的突變與人類疾病密切相關(guān), 例如，MYH6和MYH7的突變與人類多種心肌疾病相關(guān)。在人類中, MYH6和MYH7分別在心房肌纖維和心室肌纖維中表達(dá)，而在嚙齒類動物如小鼠中, 心房肌纖維和心室肌纖維均表達(dá)Myh6。Myh6 p.R403Q突變的雜合子小鼠在出生12～25周出現(xiàn)心肌纖維化、肌節(jié)異常和心功能異常的表型，敲除心肌Myh6也同樣可以使小鼠發(fā)生嚴(yán)重的心肌疾病[10]，而Myh6純合突變的小鼠呈現(xiàn)胚胎致死[11]。MYH9相關(guān)性疾病(MYH9-related disease, MYH9-RD)是一類由MYH9突變引起的遺傳性血小板減少癥, 有時突變還可引起非血液系統(tǒng)的癥狀如腎小球腎炎、神經(jīng)性耳聾和白內(nèi)障等[12]。Myh9敲除小鼠模型顯示, Myh9+/-并沒有出現(xiàn)與人類類似的MYH9-RD的癥狀, 而Myh9+/-小鼠呈現(xiàn)胚胎致死[13]。Zhang等[14]建立了3種Myh9突變(p.R702C、p.D1424N和p.E1841K)敲入小鼠模型, 發(fā)現(xiàn)p.D1424N和p.E1841K突變的純合子小鼠和三種突變的雜合子小鼠均出現(xiàn)血小板減少的癥狀，而p.R702C純合突變小鼠出現(xiàn)胚胎致死。迄今尚無文獻(xiàn)報(bào)道與MYH13相關(guān)的動物模型，故本研究是首次對Myh13敲除小鼠進(jìn)行表型分析。

在表型分析中，本研究發(fā)現(xiàn)Myh13的敲除不會導(dǎo)致小鼠發(fā)生胚胎致死的現(xiàn)象，對小鼠的體質(zhì)量、基礎(chǔ)代謝等也沒有明顯影響，說明Myh13在小鼠的胚胎發(fā)育、生長發(fā)育等過程中并不是一個至關(guān)重要的基因。Altick等[15]和田亮等[16]均發(fā)現(xiàn)斜視患者的眼外肌中MYH13表達(dá)顯著減少。HE染色的結(jié)果提示，斜視患者的眼外肌纖維橫截面積減少，數(shù)量減少、排列紊亂、結(jié)締組織增加等[17]。本研究對Myh13敲除小鼠的眼外肌也進(jìn)行了觀察, HE染色結(jié)果顯示, 與WT小鼠相比, Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的眼外肌橫截面積和肌纖維數(shù)量沒有明顯變化，且未見明顯病理改變；電子顯微鏡觀察顯示，敲除Myh13后，小鼠眼外肌中可見散在肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和脂滴沉積的現(xiàn)象。以往研究[18,19]表明，在先天性肌病和肌肉萎縮小鼠模型的骨骼肌組織中，也可見肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和脂滴沉積。本研究表明，在小鼠中，Myh13的敲除可導(dǎo)致眼外肌微觀結(jié)構(gòu)改變，這一改變是否對眼外肌功能、眼球運(yùn)動等產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步探討。