新生乳兔右心室超負荷模型的初步構建和分析

丁 雷, 王守寶, 荊 輝, 李 垚

(1. 上海兒童醫學中心, 上海 200127; 2. 上海交通大學醫學院, 上海 200025)

右心室(RV)后負荷增加和隨后出現的功能障礙,多見于伴有心室水平左向右分流的肺動脈高壓、右室流出道梗阻性疾病(如法洛四聯癥等)和RV作為循環心室的疾病(如左心室發育不良)等先天性心臟病患兒。后負荷增加早期可導致RV代償性或適應性肥大, 但持續的后負荷增加則使RV出現失代償性或適應不良性肥大, 最終導致RV功能障礙, 臨床上表現為RV充盈不良或射血功能減退。雖然RV超負荷導致心室重塑的過程和機制, 在成年動物模型中已得到廣泛研究[1-3], 但由于缺乏合適動物模型, 目前對新生哺乳動物RV肥厚和衰竭的過程和機制知之甚少。

眾所周知，未成熟和成熟的心肌細胞在許多生理、生化特性方面存在差異[4]。未成熟心肌細胞內含有豐富的糖原顆粒，其更依賴于糖酵解產生的三磷酸腺苷；同時未成熟心肌細胞亦更依賴于細胞外鈣離子觸發興奮-收縮耦聯和維持細胞內鈣穩態[5-8]。最近研究[9,10]表明，哺乳動物心臟可以在出生后1周內通過心肌細胞增殖再生，應對物理損傷和缺血性損傷。鑒于未成熟心肌細胞的上述生物學特征，成年動物模型所獲得的實驗結論并不適合直接應用在未成熟心肌細胞上。因此，構建新生哺乳動物RV超負荷模型具有重要的臨床意義。

目前常見的幼年RV超負荷模型包括： 缺氧/野百合堿誘導肺動脈高壓，進而導致RV超負荷或幼年豬肺動脈環縮(PAB)模型[11-13]。上述這些方法均不能在出生后立即導致RV超負荷。前者需要數周才能發展為肺動脈高壓, 而后者從未報道在新生大型動物上實施手術。考慮到乳兔體型小、花費少及飼養簡便, 本研究試圖對乳兔實施PAB術, 探討環縮新生乳兔肺動脈是否能成功構建出新生兔RV超負荷模型; 同時通過術后超聲心動圖、血流動力學測量以及組織學染色, 對所建立的RV超負荷模型進行了病理學及病理生理學分析評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭孕兔5只，由上海市松江區松聯實驗動物場提供[SCXK(滬)2017-0008]。孕兔分娩后，從5窩新生乳兔(不區分雄性和雌性)中隨機選擇30只分成2組： PAB組15只實施PAB手術，而假手術(Sham)組15只乳兔除肺動脈環縮步驟外，其余操作與PAB組相同。動物飼養于上海交通大學醫學院[SYXK(滬)2018-0027]。動物實驗方案經過上海交通大學醫學院實驗動物飼養與管理委員會審核通過，并嚴格按照申請的實驗方案執行。

1.2 主要實驗試劑和儀器設備

4-0絲線、6-0絲線購自寧波醫用縫線有限公司; 異氟烷購自上海玉研科學儀器有限公司; 蘇木素&伊紅(HE)染色試劑盒購自武漢百奧斯生物科技有限公司; 小動物彩色超聲成像系統(Vevo 2100)購自加拿大Visual Sonic公司; 電敏加熱板(PhysioSuite)購自美國Kent Scientific公司; 小動物麻醉誘導系統(Matrx VIP3000)購自美國Midmark公司; 顯微鏡(BX60)購自日本Olympus公司; 壓力-容積檢測系統及4.5 mm右心導管(MPVS Ultra)購自美國Millar Instruments公司。

1.3 麻醉和止痛方法

將新生乳兔置于麻醉誘導箱中使用體積分數5%異氟烷(0.2 L/min氧氣)誘導麻醉。隨后轉移到手術臺上，面罩吸入體積分數1.5%～2.0%異氟烷(0.2 L/min氧氣)維持麻醉，將動物以仰臥位固定于手術顯微鏡下方、加熱板上直至手術完成。術后通過給哺乳母兔注射曲馬多(5 mg/kg)，經過乳汁分泌對手術動物進行止痛(參考美國FDA鹽酸曲馬多使用指南)。

1.4 手術方法

體積分數75%乙醇消毒頸胸部皮膚后，于左胸側第二、三肋間隙處切開皮膚，剪斷部分胸大、胸小肌和肋間肌進入胸腔，并用眼瞼撐開器撐開肋間隙，此過程注意保護左側胸廓內動脈。隨后在立體顯微鏡下用顯微器械分離胸腺組織，打開心包，將左心耳翻向左側后，即可暴露出肺動脈主干，用顯微剪將肺動脈和主動脈之間的間隙分開以便穿過環縮線。將6-0絲線從肺動脈和主動脈之間的間隙進入，從肺動脈下方穿過，在肺動脈與左心耳之間穿出, 形成完整的閉環。最后將23G針頭(直徑0.63 mm)平行置于肺動脈上, 然后將肺動脈和針頭一起打結, 并快速移除針頭，至此環縮后的肺動脈直徑約等于針頭的直徑。打開的肋間隙用4-0絲線縫合。新生乳兔脫離麻醉, 加熱板上緩慢蘇醒, 完全蘇醒后轉移回母兔身邊。整個過程持續約16 min。除環縮步驟外, Sham組操作同PAB組。

1.5 超聲心動圖檢測

為明確肺動脈狹窄情況, 于術后14 d行經胸超聲心動圖檢查。Sham組和PAB組各隨機選取6只乳兔，使用體積分數5%異氟烷(0.2 L/min氧氣)誘導麻醉后，將動物仰臥位固定于檢測平臺上，四肢與導聯電極貼合, 面罩吸入體積分數1.5%～2.0%異氟烷(0.2 L/min氧氣)維持麻醉。檢測時，在肺動脈長軸視圖下測量肺動脈收縮期峰值壓力梯度(PPG)。所有測量結果均由經驗豐富的超聲儀器操作技師從3次連續心動周期中獲得。為排除人為偏倚，對送檢人員和超聲儀器操作技師采用雙盲。

1.6 血流動力學檢測

為明確RV血流動力學情況，于術后14 d行心導管檢測。具體檢測方法： 經同上麻醉方案后，行胸骨正中切開術和心包切開術，用27G針刺破RV。 將心導管插入孔中并定位于流出道。用配套的Power Lab系統記錄數據，并通過LabChart 7.0軟件進行分析。

1.7 組織病理學觀察

在術后14 d完成超聲心動圖和血液動力學檢測后，通過穿刺針抽取血液并迅速切除心臟，置于質量分數4%多聚甲醛固定過夜。然后，常規組織切片，行HE染色。染好切片用CaseViewer掃描系統掃描并記錄。RV游離壁厚度(RVWT)測量位置選擇三尖瓣下緣處。

1.8 統計分析

所有統計學分析采用SPSS17.0統計軟件進行。定量數據以s表示，多組間及兩組間比較分別采用單因素方差分析(One way-ANOVA)及Student t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 存活率

3只乳兔(PAB組2只, Sham組1只)術后未能蘇醒, 手術成功率為86.67%。 隨后2 d內有2只乳兔(PAB組與Sham組各1只)死于母兔踩踏。術后14 d,Sham組有13只存活, 而PAB組有12只存活, Sham組和PAB組的存活率分別為86.67%和80.00%。

2.2 超聲心動圖結果

PAB術后14 d，即可檢測到乳兔肺動脈的縮窄(圖1A，黃色箭頭)。在環縮部位和狹窄后區域，可觀察到不規則的彩色圖案，表明狹窄可導致血液出現湍流(圖1A)。在肺動脈長軸視圖下通過連續波多普勒測量肺動脈收縮期PPG，結果顯示, PAB組的PPG比Sham組平均增加21倍(圖1B)。PAB組的PPG在術后14 d為(34.05±5.66) mmHg，Sham組僅為(1.62±0.21) mmHg (圖1B)，表明在PAB手術后RV的后負荷顯著增加(P＜0.01)。

圖1 乳兔假手術(Sham)和PAB手術后14 d超聲心動圖像觀察

2.2 血流動力學結果

相較Sham組, PAB組乳兔在術后14 d右心室收縮壓顯著增加, PAB組的RV收縮壓為(45.25±5.26) mmHg, 顯著高于Sham組的(10.43±1.27) mmHg(P＜0.05), PAB組的RV舒張壓為(8.74±1.29) mmHg,也明顯高于Sham組的(3.86±0.61) mmHg (P＜0.05)。

2.3 組織學觀察

HE染色顯示，PAB組心臟在術后14 d顯著增大(圖2A)。此外，高倍鏡下可觀察到PAB組心臟心肌纖維稍紊亂，心肌細胞核增大(圖2C)，說明乳兔PAB后心肌細胞出現了重塑。

術后14 d對Sham組和PAB組RVWT進行測量，Sham組在三尖瓣下緣處的RVWT為(0.73±0.12) mm，PAB組對應位置的厚度增加至(1.42±0.27)mm (P＜0.05)。

3 討論

許多先天性心臟病患兒在出生后即存在RV超負荷，如肺動脈高壓、右室流出道梗阻以及RV作為循環心室的疾病。出生后隨著肺的膨隆，肺循環外周阻力顯著降低，并導致動脈導管和卵圓孔關閉。而患有上述疾病的患兒出生后即承受持續的RV高壓力或容量超負荷。考慮到未成熟心肌和成熟心肌之間細胞和分子特征的差異，本研究試圖構建新生乳兔的RV超負荷模型，以便更好地模擬出生后即刻出現的RV超負荷。

術后14 d PAB和Sham組的存活率分別為80%和86.67% ，表明新生乳兔對PAB手術具有相當的耐受性。盡管如此，在PAB期間也應特別小心，避免損傷大血管，因此，建議在顯微鏡下進行手術操作。與成年PAB模型相比，新生乳兔PAB 模型的RV重塑進展要更迅速。術后14 d所有經過PAB的動物均發生顯著的RV肥大, 而成年PAB模型[14-24]要在4周之后才能觀察到顯著的RV肥厚。乳兔PAB后RV血流動力學變化程度也更為顯著，與成年PAB動物RV舒張壓約2倍的增加相比[14-20], 新生PAB兔的RV舒張壓平均增加了約4倍。乳兔PAB術后RVWT的變化也更加明顯，成年動物PAB術后RVWT較術前約增加1倍，而新生兔PAB術后RVWT較術前增加了約2倍[14-20]。

圖2 乳兔術后14 d心臟組織病理學觀察

綜上所述，本實驗通過新生乳兔PAB手術成功構建了RV超負荷模型。所建立的新生乳兔RV模型與成年動物PAB術后RV重塑的進展和程度存在著某些差異，表明新生哺乳動物RV重塑的分子調節機制可能與成年不同，具體病理生理機制尚有待于進一步研究來證實。