寒地鼠耳芥室內(nèi)栽培技術(shù)

穆 丹 繆天琳 李秀霞 李春豐 姜 成

(1.佳木斯大學(xué), 黑龍江 佳木斯 154007； 2.東北林業(yè)大學(xué), 黑龍江 哈爾濱 150040)

鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)，又名擬南芥、阿拉伯芥、阿拉伯鼠耳芥、阿拉伯草，為十字花科鼠耳芥屬(擬南芥屬)草本植物[1-4]。鼠耳芥分布于北美洲、非洲西北部以及歐亞大陸，我國(guó)云南、四川、湖北、安徽、江蘇、山東、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、西藏等地均有生長(zhǎng)，一般生于平地、山坡、河邊及路邊。

植物界常見的模式生物包括玉米[7]、水稻[8]和鼠耳芥。20世紀(jì)90年代，鼠耳芥作為模式植物進(jìn)入人們的視野[5-6]。遺傳學(xué)家、植物學(xué)家和分子生物學(xué)家開始投入大量物力、財(cái)力，專注于鼠耳芥的研究。鼠耳芥植株細(xì)小，生活周期短，自交繁殖，擁有目前已知高等植物中最小的核基因組。它是第一個(gè)全部完成基因組測(cè)序的被子植物，是被譽(yù)為植物“果蠅”的有花植物研究模式材料[9-10]。鼠耳芥的研究成果為其它觀賞植物和作物的研究提供了豐富信息，為未來在屬、種、種群水平上的進(jìn)化過程研究提供支撐，并且為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[11-14]。然而，在以鼠耳芥為材料的試驗(yàn)進(jìn)程中，培養(yǎng)好鼠耳芥是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于鼠耳芥種子細(xì)小，對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，且不同地域培養(yǎng)環(huán)境有所差異，故如何培育出優(yōu)質(zhì)的鼠耳芥幼苗，掌握鼠耳芥的栽培和繁殖技術(shù)尤為重要。筆者經(jīng)過長(zhǎng)期實(shí)踐，探索出一套適于鼠耳芥室內(nèi)生長(zhǎng)的栽培改進(jìn)方法，以期為寒地鼠耳芥栽植提供詳實(shí)的參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為Columbia生態(tài)型鼠耳芥種子(ArabidopsisthalianaColumbia)，由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基。土壤基質(zhì)由腐殖土、蛭石、珍珠巖按體積比5∶2∶2均勻混合而成。澆灌液為1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 培養(yǎng)方法

野生狀態(tài)下，鼠耳芥為冬季生植物。其種子于秋季發(fā)芽，冬季時(shí)處于幼年期，花的分生組織于春季分化，夏季種子成熟、脫落，完成從生長(zhǎng)、發(fā)育到繁殖的生命全過程，周而復(fù)始，年復(fù)一年。試驗(yàn)選用土壤點(diǎn)播法和無(wú)菌移栽法。

土壤點(diǎn)播法：土壤基質(zhì)高溫滅菌，滅菌后將腐殖土、蛭石、珍珠巖充分混勻，裝入培養(yǎng)盆中，輕微震蕩使盆土平整。盆土不可過滿，培養(yǎng)盆邊沿與土面的距離控制在1～1.5 cm為宜。盆土充分吸收水分后，將消毒后的種子點(diǎn)播于土壤基質(zhì)表面(注意控制種子密度)。播種后，為保證溫濕度，培養(yǎng)盆覆蓋塑料薄膜。薄膜上均勻戳孔，以便于透氣。播種培養(yǎng)盆置于培養(yǎng)室中進(jìn)行人工光照培養(yǎng)。

無(wú)菌移栽法：將消毒后的種子均勻的平鋪于1/2 MS培養(yǎng)基上，在超凈工作臺(tái)晾干后封口。封好的培養(yǎng)皿置于組織培養(yǎng)室進(jìn)行人工光照培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)室培養(yǎng)7～9 d，長(zhǎng)出4片葉后移栽。土壤基質(zhì)的滅菌、裝盆、浸水等操作同土壤點(diǎn)播法。用鑷子將4葉期的幼苗從培養(yǎng)基上輕輕地挑出，移栽于裝有土壤基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，注意控制幼苗距離。培養(yǎng)盆上覆塑料薄膜，薄膜均勻戳孔，以便透氣。移栽后的幼苗置于培養(yǎng)室中進(jìn)行人工光照培養(yǎng)。

表1 不同培養(yǎng)方法下鼠耳芥生長(zhǎng)發(fā)育狀況

培養(yǎng)方法展葉期/d成活率/%始花時(shí)間/d開花時(shí)株高/cm蓮座直徑/cm果莢長(zhǎng)度/cm每莢種子數(shù)生活周期/d土壤點(diǎn)播法7～99637～404.9～6.05.6～6.00.9～1.140～4768～72無(wú)菌移栽法4～510030～335.2～5.85.5～5.81.2～1.346～5561～69

2 結(jié)果與分析

2.1 種子處理與播種、移栽

鼠耳芥種子播種前需進(jìn)行春化處理，置于4 ℃冰箱低溫處理3～5 d。如種子在冰箱內(nèi)儲(chǔ)存時(shí)間超過3個(gè)月，則不需進(jìn)行春化處理。

種子常帶毒、帶菌、帶蟲，播種萌發(fā)后可感染幼苗使其發(fā)病，成為傳染源。故嚴(yán)格種子滅菌消毒是保證種苗生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲害的有效方法。種子滅菌分物理消毒滅菌、生物制劑拌種以及藥物消毒滅菌3種方法。本實(shí)驗(yàn)室選用藥物消毒滅菌的方法進(jìn)行鼠耳芥種子的滅菌消毒。取種子適量，置于1.5 mL離心管中，加入無(wú)菌去離子水洗滌、震蕩數(shù)次，用移液器吸除上清液和漂浮的種子。向離心管中加入20%(v/v)的次氯酸鈉進(jìn)行種子消毒，震蕩20 s，用移液器小心吸除上清液。再次加入無(wú)菌去離子水洗滌、震蕩種子數(shù)次，吸除上清液。部分種子用于平鋪于1/2 MS培養(yǎng)基上，置于組織培養(yǎng)室，進(jìn)行無(wú)菌苗的培養(yǎng)；另一部分用于土壤點(diǎn)播法的播種。

用于種子播種和無(wú)菌苗移栽的土壤需進(jìn)行滅菌。土壤滅菌消毒是一種快速、高效殺滅土壤中真菌、細(xì)菌、雜草、病毒及病害蟲的方法，能夠保證種苗的后續(xù)生長(zhǎng)，提高種苗的品質(zhì)。待播種的土壤基質(zhì)經(jīng)121 ℃高溫滅菌30～40 min后，將腐殖土、蛭石、珍珠巖按照5∶2∶2的比例充分混勻，裝入培養(yǎng)盆。將培養(yǎng)盆置于苗盤中，每個(gè)苗盤15盆。播種前先在苗盤內(nèi)加入清水，水深1.5～2 cm。待土壤基質(zhì)充分浸透后，方可進(jìn)行播種。將消毒后的種子播于土壤基質(zhì)表面，每盆5～6個(gè)點(diǎn)，控制種子密度不可過密，否則影響生長(zhǎng)。播種后，覆蓋塑料薄膜，置于培養(yǎng)室進(jìn)行人工光照培養(yǎng)。薄膜上均勻戳孔，便于透氣，且防止土壤基質(zhì)產(chǎn)生霉菌。

運(yùn)用無(wú)菌移栽法，用于移栽幼苗的土壤基質(zhì)也需滅菌、裝盆、浸水，其操作同土壤點(diǎn)播法。用鑷子輕輕地挑出4葉期的幼苗(切勿損傷根部和莖段)，移栽于培養(yǎng)盆中，注意控制幼苗距離，不可過密。移栽后覆蓋塑料薄膜，置于培養(yǎng)室進(jìn)行人工光照培養(yǎng)。覆膜3～5 d，待緩苗成功后揭去薄膜。

2.2 不同培養(yǎng)方法下鼠耳芥的生長(zhǎng)發(fā)育

鼠耳芥在土壤點(diǎn)播法和無(wú)菌移栽法2種不同培養(yǎng)方法下，生長(zhǎng)發(fā)育狀況見表1。由表1可知，無(wú)菌移栽法種子置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行人工光照培養(yǎng)，環(huán)境培養(yǎng)條件適宜，4～5 d即展葉，且無(wú)菌苗生長(zhǎng)狀況好、長(zhǎng)勢(shì)比較均一，能夠?yàn)楹罄m(xù)試驗(yàn)提供生長(zhǎng)一致的種苗；1/2 MS培養(yǎng)基能夠?yàn)橛酌缣峁┥L(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，種苗成活率達(dá)100%；與土壤點(diǎn)播法相比，無(wú)菌移栽法培養(yǎng)的果莢長(zhǎng)且種子數(shù)多。雖然移栽后需要4～5 d的緩苗時(shí)間，但由于移栽前幼苗生長(zhǎng)健壯，移栽后緩苗迅速，生長(zhǎng)發(fā)育周期相對(duì)來說較短，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得試驗(yàn)用苗。土壤點(diǎn)播法，展葉期7～9 d，比無(wú)菌移栽法展葉晚；成活率96%，比無(wú)菌移栽法低；始花時(shí)間37～40 d，與無(wú)菌移栽法相比約晚7 d；生活周期68～72 d；此法種子直接點(diǎn)播于土壤中，培養(yǎng)室的相對(duì)濕度稍大時(shí)，土壤容易長(zhǎng)菌，影響種苗的生長(zhǎng)發(fā)育；植株長(zhǎng)勢(shì)不均一，受環(huán)境因素的影響較大。與土壤點(diǎn)播法相比，無(wú)菌移栽法培養(yǎng)的種苗展葉期和始花時(shí)間早，成活率高，每莢種子數(shù)多，植株整齊，長(zhǎng)勢(shì)均一，且生活周期短，能夠在短期內(nèi)獲得試驗(yàn)用材料，縮短了試驗(yàn)周期，是一種簡(jiǎn)易高效的鼠耳芥培養(yǎng)方法。

2.3 培養(yǎng)條件

2.3.1光照條件

光照是鼠耳芥賴以生存的最終能量來源，是對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育影響較深的環(huán)境因子之一。植物體將光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能，滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要。本實(shí)驗(yàn)室通過長(zhǎng)期實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)鼠耳芥生長(zhǎng)發(fā)育的光影響因素主要包括光照強(qiáng)度和光周期。培養(yǎng)室中光照強(qiáng)度一般通過開關(guān)燈管的數(shù)量來調(diào)節(jié)，以120～150μmol·(m2·s)-1為宜。鼠耳芥為長(zhǎng)日照植物，培養(yǎng)室一般采用16 h光照和8 h黑暗的培養(yǎng)條件。但幼苗期的鼠耳芥不耐強(qiáng)光，故生長(zhǎng)初期應(yīng)提供8 h光照和16 h黑暗的短日照培養(yǎng)。生長(zhǎng)至3～4周時(shí)依據(jù)植株生長(zhǎng)情況，也可提供10 h光照和14 h黑暗的培養(yǎng)條件。短日照有利于鼠耳芥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，長(zhǎng)日照和連續(xù)光照下促進(jìn)鼠耳芥的生殖生長(zhǎng)，花期提前，但植株葉片數(shù)量減少、種子生成受到抑制。故可根據(jù)試驗(yàn)需要，調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度和光照時(shí)間。此外，為促進(jìn)鼠耳芥的生長(zhǎng)，可適當(dāng)補(bǔ)充黃色光源。

2.3.2溫度條件

寒地早晚溫差大，秋冬季節(jié)溫度低，各季節(jié)溫度變化大，不利于鼠耳芥的生長(zhǎng)。培養(yǎng)室的溫度由中央空調(diào)嚴(yán)格控制，溫度范圍以20～25 ℃為宜。長(zhǎng)期試驗(yàn)表明，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期溫度以22 ℃最佳，植株健壯，葉片大且厚；生殖生長(zhǎng)期溫度以25 ℃最佳，同時(shí)延長(zhǎng)光照時(shí)間，可以促進(jìn)開花結(jié)實(shí)。培養(yǎng)室應(yīng)避免空調(diào)故障和長(zhǎng)時(shí)間斷電，否則影響鼠耳芥生長(zhǎng)發(fā)育。溫度過高，花的形態(tài)發(fā)育不正常，花苞容易枯萎而敗育，嚴(yán)重影響開花結(jié)實(shí)。高溫下，即使結(jié)實(shí)，果實(shí)多細(xì)弱、欠飽滿，種子發(fā)芽率降低。鼠耳芥的耐受溫度為28 ℃，但年老的植株耐受高溫的能力增強(qiáng)，水分充足時(shí)甚至可耐受30 ℃以上的高溫[15-16]。

2.3.3水分條件

水分條件是影響寒地鼠耳芥培養(yǎng)的重要因素之一。水分條件包括空氣相對(duì)濕度和培養(yǎng)土濕度。鼠耳芥喜濕潤(rùn)，培養(yǎng)室的空氣相對(duì)濕度控制在30%～75%為宜，以60%為最佳。不同生長(zhǎng)期，對(duì)于空氣相對(duì)濕度的需求存在差異。生長(zhǎng)期，空氣相對(duì)濕度宜高，有利于植株生長(zhǎng)。結(jié)實(shí)期，需降低空氣相對(duì)濕度，以利于種子的快速成熟。且結(jié)實(shí)期植株下部葉片衰老，濕度過大，易發(fā)生霉變，污染種子。

鼠耳芥不耐干旱，需保持培養(yǎng)土的微濕潤(rùn)。培養(yǎng)盆置于苗盤中，向苗盤中注入清水。通過毛細(xì)管自下而上地吸水，滿足植株的水分需求。每次澆水，水深控制在1.5～2 cm之間，不可過深過頻，影響寒地鼠耳芥生長(zhǎng)。苗盤見干后，才可再次澆水。培養(yǎng)土濕度的控制，隨著生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程而不斷變化。種子萌發(fā)需要較高的濕度，故播種后覆蓋塑料薄膜，以確保培養(yǎng)環(huán)境的濕潤(rùn)度。覆膜揭除后的幼苗期，不定期向植株進(jìn)行噴霧，依植株和土壤的干濕程度，確定噴霧量。生殖生長(zhǎng)期，停止噴霧，控制每次的澆水量。果莢變黃后，停止?jié)菜岳诜N子的采收。保持空氣相對(duì)濕度和培養(yǎng)土濕度的同時(shí)，還需注意培養(yǎng)室的通風(fēng)，以免產(chǎn)生霉菌，影響種苗品質(zhì)。

2.3.4肥分管理

為促進(jìn)鼠耳芥生長(zhǎng)，栽培過程中應(yīng)施加適量的營(yíng)養(yǎng)液和復(fù)合肥。鼠耳芥培養(yǎng)期間每周施加1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液1次，每2周施加0.3%復(fù)合肥1次，尤其是幼苗期和抽薹期的肥分管理更為重要。1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液pH值控制在5.6～5.8范圍內(nèi)，將配制好營(yíng)養(yǎng)液加入托盤，使?fàn)I養(yǎng)液由培養(yǎng)盆底部的孔上滲，避免直接澆灌對(duì)于植株的沖擊作用。營(yíng)養(yǎng)液和復(fù)合肥切勿過量，否則易產(chǎn)生“燒苗”現(xiàn)象，影響生長(zhǎng)發(fā)育。

2.3.5種子采收與保存

鼠耳芥種子著生于長(zhǎng)角果內(nèi)，長(zhǎng)角果由綠色變?yōu)辄S色，最終變?yōu)楹稚N子逐漸成熟。種子的收獲方法包括單個(gè)長(zhǎng)角果剪落收獲、套袋收獲以及商業(yè)化大規(guī)模收獲。實(shí)驗(yàn)室主要采用單個(gè)長(zhǎng)角果剪落收獲和套袋收獲兩種少量收獲的方法。其目的主要是保存種質(zhì)，用于后續(xù)研究和試驗(yàn)。

試驗(yàn)表明，當(dāng)長(zhǎng)角果變?yōu)楹稚珪r(shí)，種子成熟，是采收的最佳時(shí)期。種子采收時(shí)，用鋒利的剪刀將成熟長(zhǎng)角果剪下，置于干凈的白紙上，然后輕緩地搓揉長(zhǎng)角果，待種子完全灑落于白紙上，用滅菌后的鑷子將種莢果殼挑取干凈，最后將種子置于1.5 mL離心管中，裝入硅膠干燥劑，封口，在離心管外壁上標(biāo)記名稱、收獲時(shí)間等信息。收獲的種子先放置在4 ℃冰箱中，7 d后轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱保存。應(yīng)用此法保存的種子，一年后仍可保持95%以上的發(fā)芽率。為避免種系混雜，可選用套袋收獲法采集種子。在種子即將成熟前，用硫酸紙袋套住整個(gè)花序并封口，采收時(shí)沿基部剪下花序，輕緩搓揉后種子灑落于袋內(nèi)，去除種莢果殼等雜質(zhì)，干燥、封裝、保存步驟同單個(gè)長(zhǎng)角果剪落收獲法。

溫度和含水量是影響鼠耳芥種子保存的重要因素。溫度越高，含水量越多，則種子壽命越短。為延長(zhǎng)種子的壽命，可改變貯存條件。根據(jù)種子貯存的目的，保存方法分為短期、中期以及長(zhǎng)期保存，可依據(jù)自身需求，選擇適宜的保存方法。

2.3.6病蟲害防治

為了培養(yǎng)健康、優(yōu)質(zhì)的鼠耳芥植株用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化、突變體篩選、基因芯片及基因測(cè)序等遺傳學(xué)和分子生物學(xué)試驗(yàn)，還需加強(qiáng)病蟲害防治工作。培養(yǎng)室內(nèi)的鼠耳芥常常遇到蟲害、菌害以及苔蘚、藻類的滋生。蟲害以蚜蟲、薊馬、蘑菇蠅、白粉虱、紅蜘蛛、葉螨、白蠅為主，病害多為白粉病、灰霉病。防治鼠耳芥病蟲害的原則是以防為主，以治為輔，防治結(jié)合。定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒、滅菌，用10%的漂白粉溶液刷洗地面，用70%的酒精擦拭培養(yǎng)架、栽培用具，或用45%的百菌清煙劑薰治，或升溫至55 ℃持續(xù)24 h處理培養(yǎng)室，可有效地殺滅霉菌孢子和蟲卵。使用安全、無(wú)公害的生物發(fā)酵制品護(hù)花神花卉病蟲清(稀釋200倍)進(jìn)行噴灑和灌根處理，防治鼠耳芥的蟲害和病害。在病蟲害防治的過程中，應(yīng)有效控制處理時(shí)間和藥物濃度，以免對(duì)鼠耳芥植株造成不可逆的傷害。通過控制澆水量、定期松土、加強(qiáng)通風(fēng)，可以有效解決苔蘚、藻類的滋生。此外，培養(yǎng)室內(nèi)懸掛環(huán)保捕蟲板，可以誘殺蘑菇蠅、白粉虱等害蟲。感染病蟲害的植株應(yīng)迅速全部移除，嚴(yán)防病蟲害的傳播。

3 討論與結(jié)論

寒地城市日照時(shí)間短，冬季漫長(zhǎng)且寒冷、干燥，晝夜溫差大，季節(jié)變化明顯，不利于鼠耳芥的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)比土壤點(diǎn)播法和無(wú)菌移栽法發(fā)現(xiàn)，土壤點(diǎn)播法培養(yǎng)的植株生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)不太一致，且成長(zhǎng)過程中受到光照、溫度、土壤等環(huán)境因素的影響過大，需要更加精細(xì)地管理，從而耗費(fèi)時(shí)間和人力。由土壤點(diǎn)播法培養(yǎng)的幼苗較為嬌弱，容易感染病害、蟲害。實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的無(wú)菌移栽法培育出的鼠耳芥，初期由培養(yǎng)皿移栽到土壤基質(zhì)時(shí)較為健壯，緩苗后對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，再加上后期細(xì)致的苗期管理，植株健壯、整齊、長(zhǎng)勢(shì)一致。目前，已形成完善、簡(jiǎn)易、高效的鼠耳芥室內(nèi)無(wú)菌移栽方法，能夠?yàn)楹罄m(xù)的試驗(yàn)提供優(yōu)質(zhì)材料。

基于寒地的氣候和實(shí)際環(huán)境條件，有效調(diào)節(jié)培養(yǎng)室的光照、溫度、濕度、肥水等是鼠耳芥培養(yǎng)的關(guān)鍵。移栽初期的小苗應(yīng)避免強(qiáng)光，否則葉片褐化，生長(zhǎng)受到抑制。此時(shí)，應(yīng)減少光強(qiáng)和光照時(shí)間。隨著植株逐漸長(zhǎng)大，逐步由短日照變?yōu)殚L(zhǎng)日照。夏季溫度較高，當(dāng)溫度超過30 ℃時(shí)，鼠耳芥抽薹早，花序矮小細(xì)弱，影響種苗品質(zhì)，所以應(yīng)嚴(yán)格控制室內(nèi)溫度。冬季培養(yǎng)室內(nèi)有供暖設(shè)施，有利于鼠耳芥的生長(zhǎng)，植株更為強(qiáng)健。培養(yǎng)室的晝夜溫差控制在4～5 ℃為宜。植株結(jié)實(shí)后，應(yīng)嚴(yán)格控制空調(diào)的風(fēng)速和風(fēng)向，以免造成種子灑落和品系混雜。此時(shí)，應(yīng)使結(jié)實(shí)植株遠(yuǎn)離空調(diào)，且置于培養(yǎng)架的下部位置，以免種子灑落到其它種植盤中。培養(yǎng)室應(yīng)加強(qiáng)通風(fēng)，否則濕度大和過量供水時(shí)都容易滋生真菌、藻類和苔蘚。為保證品系的純化，防止各品系間雜交，應(yīng)注意各品系間的距離。且成株期應(yīng)及時(shí)采取立棍綁苗措施，防止植株倒伏和相互間的接觸。實(shí)踐表明，有效地調(diào)控培養(yǎng)室的光照、溫度、濕度、肥水等環(huán)境條件，輔以嚴(yán)格地栽培和管理措施，改進(jìn)的寒地?zé)o菌移栽法能夠優(yōu)質(zhì)高效地培養(yǎng)出鼠耳芥種苗滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要。