桑枝多酚的制備與其抗氧化活性成分研究△

劉鑫彤，孫登陽，葉世蕓，唐崇明，曹俊東，3*，周勝，劉江云

1.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002；2.蘇州大學醫學部 藥學院 中藥系，江蘇 蘇州 215123；3.云南省第一人民醫院 藥學部，云南 昆明 650032

桑屬植物桑MorusalbaL.是一種常用中藥，最初在《神農本草經》中有記錄，它的根也就是桑白皮，枝葉及果實等均可作為藥用。桑枝為桑的干燥嫩枝，《中華人民共和國藥典》中記錄了桑枝對于風濕、關節病有一定療效，可用來治療濕痹浮腫的癥狀。眾多學者從其枝皮中分離出了黃酮類、生物堿類等化合物。已有實驗表明，桑枝可以降壓、抗菌、明目，其藥理活性包括抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、心血管保護和免疫調節等[1]。

中國地大物博，是桑樹的產地之一，桑枝資源豐富、有深入開發利用的空間[1]。近年來對桑枝中生物堿、總黃酮等活性生物資源的研究與開發利用受到我國學者的關注[3-6]。本課題前期對桑枝中桑皮苷A、桑皮黃素兩種主要成分的含量分析方法進行了研究，發現桑枝多酚的含量與具體品種、采收期有明顯關聯[7]。本文報道桑枝多酚的制備及其抗氧化作用，為桑枝的進一步研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀；ODS色譜柱(5C18-AR-Ⅱ，250 mm×4.6 mm，日本Cosmosil公司)；BP-Purifier-100中壓液相系統(利穗科技蘇州有限公司)；Avance Ⅲ plus 400 MHz核磁共振儀(德國Bruker Daltonics公司)；UV-SPD-M20A紫外分光光度計(日本島津公司)；ME215S型電子天平(德國Starorious公司)。

1.2 試劑

AB-8等大孔樹脂(西安藍曉科技有限公司)；硅膠300～400目(青島海洋化工有限公司)；ODS硅膠(75 mm，日本Cosmosil公司)；甲醇(色譜純，上海化學試劑有限公司)；純凈水；去離子水(自制)；乙醇、過硫酸鉀、甲醇等其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

桑皮苷A對照品(純度97.2%)、桑皮黃素對照品(純度94.5%)由本實驗室自制，經NMR、UV數據進行鑒定，其純度采用液相峰面積歸一法計算；DPPH(1，1′-二苯基-2-三硝基苯肼)和ABTS(2，2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽購自日本東京化成工業株式會社。

桑枝(批號：MA121010)于蘇州大學摘取，經蘇州大學談建中教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的枝條，本實驗選用已干燥的桑枝皮進行研究。

2 方法

2.1 多酚的提取

取桑皮樣品500 g，75%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，加醇量為5 L，將兩次濾液混合，減壓濃縮至250 mL(相當于2.0 g生藥材/mL；MAP-1)，上AB-8大孔樹脂柱(100 cm×10 cm)，依次用水(5 L)、40%乙醇水(6 L)、90%乙醇水(10 L)洗脫(2 BV·h-1)，分別收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，分別得到相應柘木多酚樣品MAP-2(2.3 g)、MAP-3(0.28 g)。

取MAP-2樣品1.5 g，用20%甲醇25 mL超聲溶解，上中壓C18反相柱(40 cm×7 cm)，用20%甲醇洗脫(25 mL·min-1)，檢測波長為303 nm。收集色譜主峰1，并經HPLC檢測純度，單體流分合并、濃縮干燥，得到化合物1(380 mg，純度90.2%)。

取MAP-3樣品0.2 g，用68%甲醇5 mL超聲溶解，上中壓C18反相柱(40 cm×7 cm)，用68%甲醇洗脫(25 mL·min-1)，檢測波長為303 nm。收集色譜主峰2，并經HPLC檢測純度，單體流分合并、濃縮干燥，得到化合物2(44 mg，純度95.3%)。

2.2 桑枝多酚的大孔樹脂精制工藝

參考本課題組前期文獻方法[8]，首先采用靜態法進行大孔樹脂篩選。將8種樹脂處理后，取適量(相當于干質量1.0 g)放入錐形瓶中，加25 mL提取液，在恒溫振蕩箱中搖晃6 h(25 ℃、180 r·min-1)后，抽濾得濾液測定吸附率；飽和樹脂加25 mL 95%乙醇，相同條件下恒溫振蕩6 h，取解吸液用于液相檢測解吸附率。

采用動態吸附與解吸附實驗，優化AB-8大孔樹脂洗脫工藝。稱取相當于4.0 g干質量的AB-8濕樹脂裝柱(20 cm×1.5 cm，10 mL·BV-1)，取樣品提取液適量上樣，用適量設計的待考察乙醇濃度、體積洗脫，流速為0.5 mL·min-1，5 mL收集一次，HPLC測定流出液中桑皮苷A、桑皮黃素的含量。

HPLC條件：流動相：乙腈(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～15 min，7%A；15～30 min，7%～43%A；30～45 min，43%A；45～50 min，43%～70%A)；檢測波長為303 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為20 μL[7]。采用峰面積(Y)和樣品質量濃度(X，mg·mL-1)進行含量計算，桑皮苷A和桑皮黃素的線性方程分別為Y=8 110.3X-21.429(0.101 5～2.029 mg·mL-1，r=0.999 8)、Y=9 849.3X+81.679(0.020 42～0.408 4 mg·mL-1，r=0.999 7)。

2.3 抗氧化活性測試

參照本課題組前期文獻方法[9]進行，以維生素C作對照。各測試樣品溶液質量濃度為0.1～1.0 mg·mL-1；桑皮苷A和維生素C為0.01～0.1 mg·mL-1。用分光光度計測定DPPH·(517 nm)或ABTS·(734 nm)的吸光度Ai。并按下列公式計算各樣品對自由基的清除率。

自由基清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100

(1)

其中Ai為加入樣品反應后溶液的吸光度值，Ab為未加樣品的DPPH·或ABTS·工作液的吸光度值。

3 結果

3.1 多酚主成分鑒定

按上述方法制得桑枝多酚MAP-1～3。MAP-2、3再各經中壓反相色譜柱進一步分離，分別獲得化合物1、2。

化合物1：暗紅色粉末，易溶于甲醇、水等溶劑。

1H-NMR(CD3OD，400 MHz)：δ7.43(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.34(1H，d，J=16.4 Hz，H-α)，6.95(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.63(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.61(2H，m，H-2′,6′)，6.60(1H，m，H-3)，6.46(1H，dd，J=2.0，2.0 Hz，H-4′)，4.91(1H，d，J=7.8 Hz，H-1″)，4.88(1H，d，J=7.8 Hz，H-1?)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz) ：δ120.4(C-1)，150.1(C-2)，105.1(C-3)，156.9(C-4)，108.5(C-5)，128.4(C-6)，127.8(β-C)，126.0(α-C)，142.0(C-1′)，107.3(C-2′)，159.6(C-3′)，104.1(C-4′)，157.1(C-5′)，108.1(C-6′)，102.3(C-1″)，102.5(C-1?)，74.9(C-2″，2?)，78.1(C-3″，3?)，71.5(C-4″，4?)，78.2(C-5″，5?)，62.6(C-6″，6?)。

以上數據與文獻報道[10]對照一致，鑒定為桑皮苷A。結構參見圖1。

化合物2：黃色粉末。

1H-NMR(CD3OD，400 MHz)：δ7.07(1H，d，J=2.0 Hz，H-3′)，6.42(2H，brs，H-5′，6′)，6.23(1H，s，H-6)，5.21(1H，t，J=7.2 Hz，H-17)，5.16(1H，t，J=7.2 Hz，H-12)，3.58(2H，d，J=7.2 Hz，H-16)，3.10(2H，d，J=7.2 Hz，H-11)，1.60，1.59，1.58，1.54(each 3H，s，H-20，15，19，14)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz)：δ157.9(C-2)，121.5(C-3)，184.1(C-4)，157.1(C-5)，99.0(C-6)，163.9(C-7)，107.6(C-8)，162.6(C-9)，103.9(C-10)，24.8(C-11)，123.4(C-12)，132.6(C-13)，17.5(C-14)，25.8(C-15)，22.4(C-16)，123.0(C-17)，132.0(C-18)，17.7(C-19)，25.9(C-20)，113.7(C-1′)，160.7(C-2′)，105.5(C-3′)，161.2(C-4′)，107.9(C-5′)，132.4(C-6′)。

以上數據與文獻[11]基本一致，鑒定為桑皮黃素。參見圖1。

圖1 桑皮苷A(1)和桑皮黃素(2)結構

3.2 桑枝多酚的大孔樹脂制備工藝研究

大孔樹脂的吸附性和其化學物理性質有關，例如結構、比表面積等。選用8種常用大孔樹脂進行篩選。其對桑皮苷A和桑皮黃素的吸附特點見表1。

表1 桑枝提取液中2種主成分的靜態吸附和解吸附數據

由表1可知，所測試各型樹脂中，非極性(D101、LX-60)、弱極性(AB-8、LX-68G)樹脂對桑皮苷A和桑皮黃素吸附效果均較好；而極性樹脂和中極性樹脂對其吸附效果相對較差。進一步從解吸率分析，非極性樹脂均不如弱極性樹脂AB-8，其原因可能為桑皮苷A、桑皮黃素中的多酚類基團容易和非極性、弱極性樹脂結合，因而吸附率高；解吸附時非極性樹脂由于與溶質的分子間作用力強，更難解吸附。綜合比較，最終優選AB-8樹脂。

采用動態實驗，對AB-8樹脂柱純化桑枝多酚的制備工藝參數進行考察和優化，包括上樣液濃度和體積、洗脫液比例和體積等。其中，洗脫液中乙醇比例對兩種成分解吸附的作用見圖2。由圖可見，樹脂柱中吸附的桑皮苷A容易被20%～40%乙醇解吸附；桑皮黃素較難洗脫，60%～100%乙醇均有解吸附量。經多個單因素考察試驗研究，獲得優化的制備工藝參數：最佳上樣濃度和上樣體積為2.0 g生藥/mL共10 mL；洗脫劑選擇用水5倍體積洗去雜質，40%乙醇溶液4倍體積洗脫桑皮苷A，90%乙醇溶液6倍體積洗脫桑皮黃素。

圖2 洗脫劑中乙醇濃度與桑皮苷A及桑皮黃素動態解吸附關系

采用液相分析，測定桑枝多酚MAP-1中桑皮苷A、桑皮黃素的質量分數分別為23.7%、7.63%。經AB-8樹脂精制后，MAP-2中桑皮苷A的質量分數為40.5%，MAP-3中桑皮黃素的質量分數為43.8%。各樣品液相色譜見圖3。

3.3 抗氧化活性

使用DPPH、ABTS兩種分析方法，對桑枝多酚MAP-1～3、桑皮苷A、桑皮黃素的抗氧化活性進行測定(對照品為維生素C)。各樣品對兩種自由基的IC50值見表2。桑枝多酚MAP-1～3、桑皮苷A、桑皮黃素均對DPPH、ABTS兩種自由基具有清除作用，其中桑皮苷A活性更強，可能與其具有優良的溶解性有關。

注：1.桑皮苷A；2.桑皮黃素。圖3 桑枝多酚MAP-1～3樣品HPLC圖

表2 各樣品對DPPH和ABTS自由基的半數清除率(IC50) mg·L-1

4 結論

桑枝中成分組成復雜，其中多酚類成分是其主要有效成分之一。桑枝及柘木等同科植物中富含桑皮苷A等白藜蘆醇類抗氧化活性成分[8]，相關報道較為豐富[1，5-6，9]；其他特征性的異戊烯基取代黃酮類成分組成復雜、結構多變，但相對含量低，報道較少[1]。本課題前期HPLC檢測結果表明，桑枝多酚中的主要成分為桑皮苷A和桑皮黃素[7]。本文進一步報道其該成分分離鑒定過程和抗氧化活性測試結果，為相關研究工作提供參考。

桑枝多酚的提取和大孔樹脂精制工藝已有相關文獻報道[3-5]，但主要以總黃酮、桑皮苷A為指標成分進行研究，桑皮黃素等弱極性成分在精制過程中的含量變化未見報道。為此，本文采用大孔吸附樹脂法，進一步研究建立基于該2種主成分含量變化的桑枝多酚相關精制工藝參數，為后期研究與開發利用提供參考。研究結果表明，分別采用40%、90%乙醇洗脫，可以制備獲得較高純度的桑枝多酚MAP-2～3，工藝簡潔可行。在本實驗研究中，還參考課題組前期研究方法[8]，就AB-8樹脂對2種目標產物的靜態吸附動力學曲線(25 ℃條件下)成分進行測定，結果表明，準二級反應動力學模型模擬最佳(r=0.999 8)，表明吸附劑和吸附質均是決定吸附速率的主要因素。對不同上樣液濃度時該2種成分的吸附等溫線進行測定，結果表明，Langmuir(r>0.995)和Freundlich(r>0.986)吸附等溫線方程均適用于描述溶質分子與樹脂作用的過程；Langmuir方程表明，2種溶質在低、中壓力范圍內AB-8樹脂的吸附均屬于單分子層吸附。