黃連和枸杞子對抗精神病藥奧氮平引起胰島素抵抗的干預研究△

劉守青，呂一帆，楊妮，李士紅，張中健，王伽伯，黎維勇*，彭世勇*

1.新鄉醫學院 精神神經醫學研究院，河南 新鄉 453000；2.華中科技大學 同濟醫學院 附屬協和醫院，湖北 武漢 430022；3.中國人民解放軍總醫院 第五醫學中心 全軍中醫藥研究所，北京 100039

精神分裂癥(schizophrenia)是一組病因未明的精神疾病，以情感和行為等多方面的障礙為主要臨床特征。它在世界范圍內影響著1.3%的人群[1]，使患者預期壽命減少10～20年[2]。奧氮平作為第二代抗精神病藥(Second generation antipsychotics，SGAs)已經成為臨床抗精神分裂癥的常用藥。然而，臨床實踐發現長期服用奧氮平會引起炎癥因子[3]及胰島素通路相關蛋白異常[4-8]，會產生胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)并最終導致糖尿病[9]，從而影響奧氮平的用藥安全及依從性，然而奧氮平引起IR的機制仍尚未完全闡明。當代研究表明黃連、枸杞子等單方在糖尿病治療應用中有顯著效果[10-11]。奧氮平引起的胰島素抵抗是否能夠用中藥改善，目前鮮見報道。本實驗采用長期服用奧氮平構建的大鼠胰島素抵抗模型，進一步探究黃連、枸杞子對胰島素抵抗大鼠的干預作用。

1 材料

黃連(批號：808109，湖北辰美中藥飲片有限公司)；枸杞子(批號：812101，湖北辰美中藥飲片有限公司)。奧氮平(批號：LRAA9505，Sigma，含量>99%)；抗體(NF-κB，Cat：#8242，CST，美國，1∶1000；GGPPS，Cat：ab167168，abcam，英國，1∶2000；FAT，Cat：ab64014，abcam，英國，1∶2000；GRK2，Cat：#3982，CST，美國，1∶1000；ATGL，Cat：ab207799，abcam，英國，1∶1000；PTP1B，Cat：ab189179，abcam，英國，1∶500；GAPDH，Cat：G9545，sigma，美國，1∶5000)；胰島素ELISA試劑盒(E-EL-R2466c，伊萊瑞特)；IL-1β(E-EL-R0012c，伊萊瑞特)；IL-6(E-EL-R0015c，伊萊瑞特)；TNF-α(E-EL-R0019c，伊萊瑞特)；血糖儀及血糖試紙(羅氏診斷產品有限公司)；BCA蛋白質濃度測定試劑盒(AS1086，ASPEN)；PBS溶液(AS1044，ASPEN)；實驗用水為超純水。黃連和枸杞子均采用10倍水煎煮，黃連煎液含小檗堿為32.8 mg·mL-1，枸杞煎液含甜菜堿為104 ng·mL-1。

2 方法

2.1 實驗動物

40只8周齡SPF級雌性SD大鼠，購自湖北省疾控中心，動物實驗使用許可證號為：SYXK(鄂)2010-0057。隨機分為對照組(BL)、奧氮平組(OLZ)、黃連組(CR)、枸杞子組(LF)，每組10只。根據臨床上奧氮平多巴胺受體占用率[12]，確定SD大鼠單日劑量1.5 mg·kg-1，灌胃8周，奧氮平組胰島素抵抗指數與對照組有統計學差異表明建模成功。根據《中華人民共和國藥典》推薦，黃連以內服煎湯最大劑量5 g·d-1換算成大鼠劑量514 mg·kg-1灌胃給藥，枸杞子以內服煎湯最大劑量12 g·d-1換算成大鼠劑量1.234 g·kg-1灌胃給藥。奧氮平組和黃連組、枸杞子組每天灌胃奧氮平1.5 mg·kg-1，然后再分別對黃連組、枸杞子組灌胃中藥，空白組給予同等劑量的無菌0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組SD大鼠每天灌胃處理，連續喂養8周。

2.2 空腹血糖及胰島素抵抗指數測定

大鼠禁食12 h后，第2、4、6、8周從大鼠的眼眶后靜脈叢采血，用血糖儀測血糖水平。其余的血液樣品置于添加了肝素的EP管中，收集血漿，并采用胰島素ELISA試劑盒測定雌性SD大鼠血漿中胰島素水平。有研究表明，奧氮平導致的糖尿病發生和進展中的主要病理生理因素是引起了胰島素抵抗，而胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment insulin，HOMA-IR)是評估糖尿病一級預防的關鍵指標[13]。按公式(1)計算HOMA-IR，評估大鼠的胰島素敏感性。

(1)

2.3 蛋白質免疫印跡(Western-blot)和ELISA實驗

第8周大鼠禁食12 h后，采集大鼠眼眶后靜脈叢血樣，置于添加了肝素的EP管中，并分離腹膜后白色脂肪組織在-80 ℃下保存備用。采用Western-blot技術，電泳電壓80 V，電泳至分離膠后將電壓改成120 V；采用電流300 mA，90 min轉膜；5%脫脂奶粉封閉2 h；一抗抗體按說明書進行配比，一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；曝光儀曝光。測定SD大鼠脂肪組織中NF-κB、FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的蛋白表達水平。檢測第8周血漿中炎癥因子，采用ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平。

2.4 統計分析

3 結果

3.1 黃連、枸杞子降低奧氮平組大鼠的胰島素抵抗

測量大鼠空腹血糖、胰島素水平并計算胰島素抵抗指數。空腹血糖結果如圖1A所示，對比于BL組，OLZ組大鼠在第6、8周空腹血糖值顯著升高了25%、17%(P<0.05)。對比于OLZ組，LF組的大鼠第6、8周空腹血糖值顯著降低了11%、13%(P<0.05)。結果表明8周后，枸杞子可以顯著降低奧氮平導致的高空腹血糖水平，黃連并未有此效果。大鼠血漿胰島素結果如圖1B所示，對比于BL組，OLZ組大鼠在第2、4、6、8周胰島素水平顯著升高了49%、74%、69%、45%(P<0.05)。對比于OLZ組，CR組的大鼠第2、4、6、8周胰島素水平分別降低了19%、31%、33%、31%(P<0.05)。對比于OLZ組，LF組的大鼠第4、6、8周胰島素水平顯著降低了26%、23%、28%(P<0.05)。結果表明從第四周開始，黃連、枸杞子均可以顯著降低奧氮平引起的高胰島素水平。HOMA-IR結果如圖1C所示，對比于BL組，OLZ組大鼠在第2、4、6、8周HOMA-IR顯著升高了29%、84%、114%、70%(P<0.05)。對比于OLZ組，CR組的大鼠第4、6、8周HOMA-IR顯著降低了32%、37%、36%(P<0.05)。對比于OLZ組，LF組的大鼠第4、6、8周HOMA-IR顯著降低了29%、32%、37%(P<0.05)。結果表明黃連、枸杞子均可以顯著降低奧氮平引起的HOMA-IR的升高。

注：A.空腹血糖；B.胰島素；C.胰島素抵抗指數；與對照組比較，*P<0.05；與奧氮平組比較，#P<0.05；下同。圖1 各組大鼠空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數的比較

3.2 黃連和枸杞子抑制奧氮平組大鼠脂肪組織中NF-κB的水平

本實驗室前期研究已經發現奧氮平引起炎癥反應[3]，并且引起NF-κB的活化，NF-κB可在組織細胞內啟動炎癥反應[14-15]，這些是導致胰島素抵抗的重要因素。本研究通過蛋白質印跡技術全面分析大鼠脂肪組織樣本，各組樣本加樣順序如圖2A所示。灰度值分析結果如圖2B顯示，與對照組對比，奧氮平組、黃連、枸杞子組中的NF-κB表達量分別增加了453%、227%、171%(P<0.05)。但黃連、枸杞子組對比于奧氮平組，脂肪組織的NF-κB分別顯著降低了41%、51%(P<0.05)。結果表明黃連、枸杞子組NF-κB并未恢復到對照組的正常水平，即使如此，黃連和枸杞子依然顯著降低了奧氮平組中的NF-κB水平。

注：A.蛋白質印跡技術代表膠片；B.蛋白質印跡灰度。圖2 各組大鼠脂肪組織NF-κB比較

3.3 黃連、枸杞子降低奧氮平組大鼠血漿中炎癥因子的水平

為了闡明黃連、枸杞子對奧氮平組大鼠血漿中炎癥因子表達的影響，本實驗采用ELISA檢測了大鼠血漿中炎癥因子的表達水平。如圖3所示，與對照組相比，奧氮平組大鼠的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6分別顯著增加了91%、118%、147%(P<0.05)。對比于奧氮平組，黃連組的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6分別顯著降低了43%、49%、48%(P<0.05)，枸杞子組的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6分別顯著降低了44%、47%、48%(P<0.05)。結果表明黃連、枸杞子顯著降低奧氮平組的炎癥因子水平，且已恢復至正常狀態。

注：A.IL-1β；B.TNF-α；C.IL-6。圖3 各組血漿炎癥因子箱形圖

3.4 黃連和枸杞子降低奧氮平組大鼠脂肪組織中胰島素抵抗相關蛋白的表達

研究發現FAT在體內的表達上調有促進脂肪形成的功能，同時FAT水平升高會增加胰島素抵抗的風險[4]。PTP-1B敲除的小鼠會失去對胰島素和瘦素信號的傳導抑制，小鼠在高脂飲食下不出現肥胖或胰島素抵抗[5]。在脂肪細胞中，可通過GGPPS阻斷胰島素信號通路導致胰島素抵抗[6]。GRK2是胰島素作用的重要負調節因子，是胰島素抵抗和肥胖發病機理的關鍵因素之一[7]。ATGL分解的游離脂肪酸利用率下降，提高了葡萄糖的利用率，進而增加葡萄糖耐受性和胰島素敏感性[8]。以前的研究發現這些脂肪細胞信號蛋白表達異常是胰島素抵抗的關鍵因素，并且在糖尿病疾病中高度活化。蛋白質印跡技術全面分析各組樣品，如圖4A所示。圖4B～F的灰度值統計結果顯示與對照組對比，奧氮平組中FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的平均相對表達水平分別升高了425%、257%、513%、178%、166%(P<0.05)。對比于奧氮平組，黃連組的FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的平均相對表達水平分別顯著降低了57%、39%、55%、50%、51%(P<0.05)，枸杞子組的FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的平均相對表達水平分別顯著降低了66%、43%、61%、58%、45%(P<0.05)，結果表明黃連、枸杞子組顯著降低了奧氮平組中胰島素抵抗相關蛋白的表達量。對比于對照組，黃連組中GGPPS、PTP-1B仍然增加了116%、173%(P<0.05)，枸杞子組中GGPPS也增加了104%(P<0.05)，表明GGPPS可能在黃連和枸杞子降低胰島素抵抗中不起主要作用，PTP-1B可能在黃連組降低胰島素抵抗中不起主要作用。總之，這些數據表明黃連、枸杞子對奧氮平組中胰島素抵抗相關蛋白FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL異常表達有明顯改善作用。

注：A.蛋白質印跡技術代表膠片結果；B～F.蛋白質印跡灰度值分析。圖4 各組大鼠脂肪組織胰島素抵抗相關蛋白比較

4 討論

已有研究表明抗精神病藥奧氮平治療中伴發IR及糖脂代謝異常[16]，成為了奧氮平臨床治療中不可回避的問題，嚴重影響著臨床奧氮平長期治療的依從性；并且有研究表明胰島素抵抗和炎癥反應有密切相關性[17]，NF-κB是組織細胞內普遍存在的可誘導核轉錄激活的因子，對啟動、調節炎癥反應起關鍵作用[18]。在雌性大鼠[19]、健康男性受試者[20]長期服用或細胞實驗[21]給藥奧氮平后可以引起炎癥反應，某些研究甚至認為IR是一種慢性炎癥狀態[22]。已有研究表明FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL這些脂肪細胞信號蛋白高度表達是產生IR的關鍵因素[4-8]。臨床上通常是在患者出現這些不良反應后進行對癥處理，對奧氮平進行減量、聯合其他藥物治療或更換其他藥物。已有研究使用二甲雙胍[23]、托吡酯[24]、倍他司丁[25]、阿立哌唑[26-27]等可以減輕抗精神病藥物治療引起的不良反應，但治療效果有限或不適合長期給藥，甚至可能引起其他不良反應。因此，尋找一種有效且不良反應小的藥物來治療奧氮平等非典型抗精神病藥引起的代謝相關不良反應或者找到治療這些不良反應的靶點至關重要。

黃連口服不良反應小、安全性好，枸杞子則是藥食兩用的中藥。這些特性是今后有效篩選中藥復方和新藥改善抗精神分裂藥物奧氮平所致胰島素抵抗防治的重要基礎。盡管前人研究表明黃連、枸杞子對高糖誘導的胰島素抵抗有干預作用[28-29]，黃連可以通過改善內質網應激[30]，激活AMPK[31]，反轉IRS磷酸化[32]等方式降低胰島素抵抗。枸杞子可以通過提高胰島素信號傳導通路相關蛋白IRS2、PI3K、Akt、GLUT2的表達[33]，降低resistin基因mRNA表達[34]等方式改善胰島素抵抗。黃連中小檗堿[35]、藥根堿[36]等具有改善胰島素抵抗、降低血糖的作用，枸杞子的有效成分枸杞多糖[37]能通過提高2型糖尿病大鼠的胰島素敏感性，實現降低血糖的作用。但這兩味中藥對奧氮平引起的胰島素抵抗的干預機制，尚未有文獻報道。因此本研究旨在通過動物實驗探討黃連、枸杞子對奧氮平灌胃所致的大鼠IR相關代謝指標的改善作用。HOMA-IR是衡量IR的指標[38]，本結果顯示奧氮平組HOMA-IR顯著高于對照組，表明大鼠長期服用奧氮平已產生胰島素抵抗。黃連、枸杞子均顯著降低了奧氮平引起的高胰島素和高HOMA-IR水平，但只有枸杞子顯著降低了奧氮平引起的高血糖水平。這些結果表明黃連通過降低胰島素水平改善HOMA-IR，枸杞子通過降低血糖和胰島素水平改善HOMA-IR。此外，黃連、枸杞子對于降低奧氮平組NF-κB、炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)、IR相關蛋白也有顯著效果，但是對其中的GGPPS、PTP-1B并未恢復到正常對照的水平(見圖2)。這些結果表明奧氮平誘導的胰島素抵抗可能有更復雜的機制存在，提示今后可以從中藥配伍復方方面改善奧氮平的不良反應。

本研究首次運用黃連、枸杞子對奧氮平引起的胰島素抵抗大鼠模型進行干預治療，取得了良好效果，為治療抗精神病藥奧氮平引起的胰島素抵抗和新生糖尿病聯合用藥提供了新的思路。雖然本次研究沒有在前人研究提示基礎上具體分析黃連、枸杞子的單分子成分是否有效抵抗奧氮平所致胰島素抵抗作用，但是這些結果將為今后進一步研究黃連、枸杞子有效成分抗胰島素抵抗和臨床干預研究指明具體方向。