鹽度對巖扇貝Na+/K+-ATP酶活性的影響

王堯 曹善茂

摘 要：巖扇貝為國內引進的新品種，為了彌補國內在鹽度對巖扇貝影響這方面研究的空白，利用從加拿大引進的巖扇貝Crassadoma gigantea幼貝，經過在不同鹽度梯度（高鹽36，正常30，低鹽24）及不同鹽度變化速率馴化后，取樣，選取幼貝內臟團，采用試劑盒檢測方式，檢測不同鹽度梯度下巖扇貝Na+/ K+-ATP 酶活性的表達。結果表明：在鹽度30下，Na+/K+-ATP酶活性維持在較高水平，而在高鹽36脅迫下，酶活力較鹽度30的低，且在鹽度驟變情況下尤為顯著;在低鹽24脅迫下，酶活性同樣較鹽度30下的酶活力低，且相對高鹽脅迫活性更低

關鍵詞：巖扇貝;鹽度;Na+/ K+-ATP酶

巖扇貝Crassadoma gigantea隸屬于軟體動物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、珍珠貝目Pterioida、扇貝科Pectinidae。[1]廣泛分布于北美太平洋沿海，自阿拉斯加到加利福尼亞半島和墨西哥灣海岸等沿海地區，從潮間帶到深至100米的海底均有分布。巖扇貝個體較大，肉質鮮美，養殖周期短，生長較快，適應的溫度范圍廣，經濟價值高，適合我國北方引種養殖。[7]

國外已有對巖扇貝的風味口感[2]、各種脂肪酸含量等營養成分[2]、產品冷藏肉質穩定性[3]的報道，并為育苗做了關于巖扇貝繁殖周期與排精產卵機制[4]、育苗的餌料種類及配比[5]、幼苗的附著生理[6]等方面的研究，但國內對巖扇貝的研究較少，僅有室內人工育苗技術[7]、海上中間育成[7]、幼貝攝食規律與環境適應能力[8]、閉殼肌高蛋白低脂肪的營養特點[9]等基礎研究。

而鹽度是貝類養殖過程中的重要水環境因子，對貝類機體呼吸、生長、抗氧化水平及免疫功能具顯著影響[10]，海水鹽度易受降雨、氣候、河流徑流等影響而發生變化甚至驟變，導致海水貝類抗氧化酶及免疫相關酶活性升降變化，貝類常因此而大量死亡，使養殖產業遭受經濟損失。[11]Na+/ K+-ATP 酶存在于細胞膜，起著物質運輸、能量轉換及信息傳遞等重要作用，機體在遭受環境脅迫或疾病狀況下，此酶活性發生改變。[12-14]因此，研究鹽度變化與貝類的Na+/ K+-ATP酶活性變化關系對養殖生產具有重要意義。目前已發現鹽度變化對日本沼蝦[12]、大菱鲆[13]、紅耳龜[14]、仿刺參[15]等水產動物的Na+/ K+-ATP酶活性產生顯著差異。

目前國內外在鹽度對巖扇貝生理指標影響方面已做了研究，而未有鹽度對巖扇貝生化指標影響的報道。國內一些研究表明巖扇貝鹽度適應范圍大約在24～36。[16]實驗通過研究鹽度對巖扇貝Na+/ K+-ATP 酶活性的影響，以完善巖扇貝的生化指標理論，為今后的人工育苗、養殖生產等實踐提供依據與指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗地點

大連海洋大學海養樓重點實驗室

1.1.2 扇貝來源

試驗用的巖扇貝為引自加拿大的巖扇貝幼貝，選取活力良好、發育正常、規格相近、殼長為2-3 cm的幼貝90枚。

1.1.3 水質監測

暫養期間幼貝養殖水體鹽度為30;在實驗期間，三個實驗組的幼貝養殖水體鹽度分別維持在三個梯度：高鹽36、正常鹽度30、低鹽24。

1.2 實驗方法

1.2.1 幼貝暫養馴化

將12月份從加拿大引進的巖扇貝幼貝在大連海洋大學海養樓重點實驗室控溫循環水族箱中暫養7d，暫養期間鹽度為30，水溫14±0.3℃，持續充氣，每天投喂小新月菱形藻（Rhomboid alga）25×104 cells/mL，視水色及幼貝攝食情況增減投餌量，每天全量換水。并觀察幼貝的健康狀況以期各條件狀況趨于穩定。

1.2.2 鹽度驟變實驗

將暫養后各方面條件趨于穩定的幼貝分別放在高鹽36、正常鹽度30、低鹽24中馴化天，鹽度設三個梯度，高鹽36、正常鹽度30、低鹽24分別為每個梯度三個平行，每個平行處理10個扇貝。低鹽組的海水從正常海水鹽度開始每天降3，依次為30、27、24;正常海水對照組的海水維持正常海水鹽度30，其中上下波動應不超過1;高鹽組的海水從正常海水鹽度開始每天升3，依次為30、33、36。在達到既定鹽度值24、30、36后設時間點0，4，8，12，24，36，48小時，每個時間點分別從各個實驗組中取樣一次。

1.2.3 鹽度漸變實驗

低鹽組的海水從正常海水鹽度開始每天降1，從30降低到24;正常海水對照組的海水維持正常海水鹽度30，其中上下波動應不超過1;高鹽組的海水從正常海水鹽度開始每天升1，從30提升到36。在達到既定鹽度值36、30、24后，每3天分別從不同實驗組取樣一次。

1.2.4 酶活性測定

從不同實驗組中抽取的樣品，選取內臟團，根據計算要求設置空白對照管，標準對照管，測定管，分別測 Na+/ K+-ATP 酶活性，Na+/ K+-ATP酶活性的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

Na+/ K+-ATP 酶活力測定原理為ATP酶可分解ATP生成ADP和無機磷，測出無機磷的含量后利用公式可判斷出ATP酶活力的高低。其活性單位定義為每小時1mg組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個ATP活力單位，即微摩爾磷/毫克蛋白/小時（μmolPi/mgprot/hour）。

最后要測樣本蛋白濃度用以上一公式的計算。蛋白定量原理為蛋白質分子具有-NH4+ 基團，棕紅色的考馬斯亮藍顯色劑加入蛋白標準液或樣品液時考馬斯亮藍顯色劑上的陰離子與蛋白的-NH4+結合，使溶液變為藍色，通過測定吸光度計算蛋白含量。

1.2.5 數據處理

用Excel輸入數據、生成圖表后進行分析。

2 結果與分析

2.1 鹽度急性實驗

鹽度驟變Na+/ K+-ATP 酶活力：隨著鹽度的驟變和馴化時間的不斷延長，各組樣本內臟團Na+/ K+-ATP酶活力變化見表1、表3，鹽度30的對照組樣本內臟團Na+/ K+-ATP酶活力變化見表2。

將各個鹽度梯度的8個樣本的Na+/ K+-ATP 酶活性數據作平均值，得到鹽度30-36、30-24驟變和鹽度30隨時間延長的變化趨勢（見圖1）。由圖1可見，鹽度36組在4h-12h內Na+/ K+-ATP 酶活力持續較低，24h-48h活力呈先上升后下降的變化趨勢。鹽度24組在48h內出現兩次先上升后下降的趨勢，在12h、36h出現兩個峰值。鹽度30的對照組酶活力呈上升趨勢。48h內鹽度36組與24組總體均較對照組活性較低，而24組總體較36組活性低。

2.2 鹽度漸變實驗

鹽度漸變Na+/ K+-ATP酶活力：隨著鹽度的漸變和馴化時間的不斷延長，各組樣本內臟團Na+/ K+-ATP酶活力變化見表4、表6，鹽度30的對照組樣本內臟團Na+/ K+-ATP酶活力變化見表5。

將各個鹽度梯度的8個樣本數據作平均值，得到鹽度30-36、30-24漸變和鹽度30隨時間延長的變化趨勢（見圖2）。由圖2可見，鹽度36組在第3d-第9d有小幅度的先降后升的趨勢，第9d后Na+/ K+-ATP 酶活力呈緩慢下降趨勢。鹽度24組酶活在第12d出現略微上升。鹽度30的對照組在18d酶活力呈略微波動變化。18d內鹽度36組與24組比對照組活性顯著較低，而24組比36組整體活性較低。

3 結論

Na+/ K+-ATP酶參與Na+、K+跨膜主動運輸，當水體鹽度發生變化時，生物體內的離子平衡容易受鹽度變化影響，生物體內的Na+/K+-ATP酶活性出現相應變化來對抗這種不平衡，用以維持離子穩態及滲透壓平衡，Na+/ K+-ATP酶除能穩定滲透壓平衡外，還為鰓、腎臟離子調控提供驅動力。而高鹽或低鹽可破壞生物膜結構，膜上Na+/K+-ATP酶活性也隨之降低。有研究報道，仿刺參在鹽度20-35范圍內時，鹽度越高，Na+/K+-ATP酶活性則越高，當鹽度高于35或低于20時，其Na+/K+-ATP酶活性降低。錢佳慧等研究表明，華貴櫛孔扇貝幼貝受鹽度影響Na+/K+-ATP酶活性變化顯著，且隨鹽度升高而呈先升后降的趨勢，并發現在30.67時活力最高。這種受鹽度脅迫Na+/K+-ATP酶活性隨鹽度變化而逐步升高或下降，達到最高和最低時逐漸適應的現象在褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、擬穴青蟹（Scylla Paramamosain）、軍曹魚（Rachycentron canadum）水生動物中均存在。這表明了Na+/K+-ATP酶在水生生物調節細胞滲透壓時起重要作用，且在最適鹽度下，活力最大。本實驗發現，在鹽度30下，Na+/K+-ATP酶活性維持在較高水平，而36高鹽脅迫下，酶活力較適鹽范圍下的酶活力低，且在鹽度驟變情況下尤為顯著，與研究結論符合;24低鹽脅迫下巖扇貝幼貝的Na+/K+-ATP酶活性同樣較適鹽范圍下的酶活力低，其活性相對高鹽脅迫活性更低。

本實驗結果表明，鹽度對巖扇貝適應生存環境具有顯著影響，且與低鹽脅迫相比下，巖扇貝對高鹽脅迫的適應性相對較強。因此在巖扇貝引種馴化或人工養殖時應充分考慮鹽度變化的影響，可以考慮培育耐高鹽品種。

參考文獻：

[1]王如才，王昭萍.海水貝類養殖學[M].青島：中國海洋大學出版社出版，2008.

[2]Phleger C F，Holtz RB，Grimes P W，et al.Chemical and sensoryanalysis of the purple-hinge rock scallo Hinnites multirugosus Gale[J].Journal of Food Science，1978，43（6）：1793-1796.

[3]Maxwell-Miller G，Josephson R V，Spindler A A，et al.Chilled（5℃）and frozen（-18 ℃）storage stability of the purple-hingerock scallop，Hinnites multirugosus Gale[J].Journal of Food Science，1982，47（5）：1654-1661.

[4]Laurén D J.Oogenesis and protandry in the purple-hinge rock scallop，Hinnites giganteus，in upper Puget Sound，Washington，U.S.A.[J].Canadian Journal of Zoology，1982，60（10）：2333-2336.

[5]Cary S C，Leighton D L，Phleger C F.Food and feeding strategies inculture of larval and early juvenile purplehinge rock scallops，Hinnites multirugosus（GALE）[J].Journal of the World Aquaculture Society，1981，12（1）：156-169.

[6]Culver C S，Richards J B，Page H M.Plasticity of attachment in the purple-hinge rock scallop，Crassadoma gigantea：implications forcommercial culture[J].Aquaculture，2006，254（1-4）：361-369.

[7]曹善茂，汪健，王謙，等.巖扇貝人工育苗的初步研究[J].大連海洋大學學報，2017，32（1）：1-6.

[8]曹善茂，梁偉鋒，汪健，等.巖扇貝幼貝濾食率的基礎研究[J].大連海洋大學學報，2016，31（6）：612-617.

[9]曹善茂，王昊，陳煒，等.巖扇貝閉殼肌營養成分的分析及與中國 3 種扇貝的比較[J].大連海洋大學學報，2016，31（5）：544-550.

[10]肖克宇，陳昌福，李月紅，等.水產動物免疫學[M].北京：中國農業出版社，2011：91-92.

[11]錢佳慧，栗志民，申玉春，等.溫度和鹽度對華貴櫛孔扇貝抗氧化酶活性的聯合效應研究.南方水產科學.[J].南方水產科學，2015.11（6）：49-50.

[12]Wang W，Wang A，Liu Y，et al.Effect of temperature on growth，Adenosinephosphates，ATP ase and cellular defense response of juvenile shrimp Macrobrachium nipponense[J].Aquaculture，2006，256（1）：624-630.

[13]Imsland A K，Gunnarsson S，Foss A，et al.Gill Na+，K+-ATPase activity，plasma chloride and osmolality in juvenile turbot（Scophthalmus maximus）reared at different temperatures and salinities.[J].Aquaculture，2003，218（1）：671-683.

[14]張珂，洪美玲，史海濤，等.鹽度脅迫對紅耳龜Na+/K+-ATP酶及消化酶活性的影響[J].水產科學，2014，33（8）：520-524.

[15]王茂林，李岑，楊敏，等.鹽度對仿刺參存活和Na+/K+-ATP酶活性的影響[J].漁業現代化，2014，41（1）：6-9.

[16]梁偉鋒.不同因子對巖扇貝攝食率、耗氧率和排氨率的影響[D].大連海洋大學，2016.