西藏絨山羊的微衛星多態性與部分經濟性狀的關聯分析

德 吉，巴 貴，吳玉江，索朗達，袁 超，次仁德吉*

（1.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏拉薩 850009；

2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

微衛星（Microsatellite）是廣泛分布于真核生物基因組中的簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR），一般由2～6個堿基組成核心單元，重復類型分為單一型、復合型和間斷型[2]。微衛星DNA符合孟德爾遺傳模式，在真核生物基因組中廣泛分布且數量龐大，具有分布均勻、多態性豐富、易于檢測等特點[3]，作為優良遺傳標記而廣泛用于農作物和畜禽遺傳育種領域[4-5]。張建軍等對隴東絨山羊9個微衛星多態性進行分析表明所選的微衛星標記顯示為高度多態，可用于遺傳多樣性評估[6]。張延虎等利用BM6438、BMS2782、BM1824等7個微衛星標記在南疆絨山羊群體中進行多態性分析，表明所選的微衛星標記均為高度多態，可以成為與經濟相關的遺傳標記[7]。古麗尼沙·吐拉甫等研究了9個微衛星在青格里絨山羊中的多態性，并與部分生產性能進行相關性分析，發現OarHH35、BM3033、BM1824、BMS1788可以作為青格里絨山羊細度或產絨量的分子標記[8]。

西藏絨山羊是我國絨肉兼用型地方品種，是我國的一大寶貴家畜品種資源，主要分布在西藏阿里地區日土縣、那曲地區尼瑪縣等羌塘草原地區[1]，具有耐粗放、抗逆性強、羊絨細長柔軟、產絨性能良好、品質優良、絨纖維細度在14μm左右等特點。目前，國內外對綿、山羊的微衛星標記研究報道較多，但對西藏絨山羊的研究還未見報道。本研究利用PCR-SSCP技術對西藏絨山羊10個微衛星進行多態性分析，對其多態性與其產絨量、細度、長度等產絨性狀的關聯性進行系統分析，為西藏絨山羊標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

頸靜脈采集5 mL/只共計340份西藏自治區絨山羊保種場（阿里地區日土縣、措勤縣和尼瑪縣）成年絨山羊血液，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20℃保存。

體重、體長、絨長、產絨量等生產記錄由各保種場提供。

1.2 主要儀器和試劑

PCR儀（ProFlexTMPCR）、離心機（Eppendorf 5424）、電泳槽（Mini-Protean Tetra Electrophoresis System）等。以上儀器及設備由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所動物育種實驗室提供。

血液基因組DNA提取試劑盒（DP318-03）（購自天根生化科技＜北京＞有限公司）、Taq DNA聚合酶（購自大連寶生物工程有限公司）、其他常規試劑均為進口或國產分析純級產品（購自蘭州博樂知生物科技有限公司）。

1.3 血液基因組DNA提取

血液樣品基因組DNA的提取參照天根血液基因組DNA提取試劑盒說明書。提取的基因組DNA通過核酸蛋白分析儀測定其濃度，于-20℃保存。

1.4 引物設計

根據微衛星選擇標準，并參考前人研究結果，在Genbank中查找綿、山羊的微衛星標記，篩選出10個微衛星標記引物序列，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used formicrosatellite amplification

1.5 PCR擴增

PCR反應體系為：Premix Taq 12.5μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L），DNA 1 μl（20 ng/μl），ddH2O 9.5 μl，共計 25 μl。

反應程序為：94℃預變性5 min；35個循環（94℃ 30 S，退火溫度 30 S，72℃ 1 min）；72℃延伸10 min，4 ℃保存。

各PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 PCR-SSCP分析

取5μl的PCR產物在8%的非變性聚丙烯凝膠100 V電壓條件下，4℃電泳4 h，銀染法顯色后拍照。

根據最終的成像膠圖分析各微衛星全部個體的基因型。

1.7 數據處理及統計分析

應用 EXCEL軟件計算基因型頻率，并采用SPSS 20.0軟件對西藏絨山羊不同個體基因型數據與部分經濟性狀數據（包括體長、體高、絨長、毛長等）相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

采用試劑盒法提取340份西藏絨山羊血液基因組DNA，提取的基因組DNA用1%瓊脂糖膠進行完整性檢測（圖1），由圖可見，條帶清晰，均無拖帶，符合分子生物學實驗要求，用作后續試驗。

2.2 PCR擴增

以西藏絨山羊血液基因組DNA為模板，用10對引物進行擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1。由圖1可知，PCR產物中均有清晰的DN A擴增條帶大小為100～250 bp之間，擴增條帶單一。

圖1 部分基因組DNA瓊脂糖電泳Fig.1 Part of genomic DNA agarose electrophoresis results

圖2 微衛星BM S1248擴增產物Fig.2 Agarose electrophoresis results of PCR product ofmicrosatellite BMS1248

2.3 PCR-SSCP分析

對340份西藏絨山羊的10對微衛星擴增產物用8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳結合銀染法判斷等位基因的大小，部分結果見圖3～4。10對微衛星引物除BM6438無多態性，其它都表現明顯的多態性。通過帶型進行基因分型，并統計基因型頻率，結果見表2，9個微衛星位點基因型在5個以上，其中BMS1788位點有9個基因型。

2.4 9個微衛星位點多態性與生產性狀關聯分析

利用SPSS22.0統計軟件對每個基因型與經濟性狀進行關聯分析，其中基因型頻率10%以下的不做分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，主要對體長、體高、胸圍、羊絨長度、羊毛長度5項指標進行分析。由表3可見，在體長性狀中，位點BM3033的基因型6顯著高于其他基因型個體（P＜0.05），其他位點基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在體高性狀中，位點BMS1248的基因型1和位點BM3033的基因型6顯著高于其他基因型，其他位點基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在胸圍性狀中，位點BMS1248的基因型2和位點BM3033的基因型6顯著高于其他基因型個體（P＜0.05），其他位點基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在絨長性狀中，位點BMS1788的基因型3顯著高于其他基因型個體（P＜0.05），其他位點基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在毛長性狀中，位點BM3413的基因型1和基因型2顯著高于其他基因型個體（P＜0.05），其他位點基因型間差異不顯著（P＞0.05）；位點BMS1724、MCM38、BM6506、LSCV15、BMS2782 各基因型在體長、體高、胸圍、絨長、毛長性狀中差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 微衛星BMS1248的部分PCR產物8%PAGE電泳檢測Fig.3 Portion of 8%PAGE results of BMS1248

圖4 微衛星BM 3033的部分PCR產物8%PAGE電泳檢測Fig.4 Portion of8%PAGE results of BM3033

表2 9個微衛星位點的基因型特性Table 2 Genotypic characteristics of9 microsatellite loci

3 討 論

目前采用微衛星標記進行畜禽選種育種輔助選擇是速度最快、頻率最高和可靠性最好的方法，可以在最短的時間內對群體中不期望出現的基因變異個體進行淘汰[9]。一般是先檢測微衛星位點的多態性并進行基因型判定，然后利用數學統計方法對個體表型值和基因型的關聯程度進行分析，最終找到和重要性狀連鎖的DNA標記。

古麗尼沙·吐拉甫選取17個微衛星位點在新疆山羊與青格里絨山羊進行多態性分析發現其中13個具有多態性且均為高度多態，與兩個絨山羊群體經濟性狀進行關聯分析發現MCM38的FH型、MCM38的FI型、MAF70的BF型和BMS1724的CC型可作為新疆山羊絨細度、絨長度、產絨量和含絨率的候選標記的優勢基因型，LSCV15的BD型、BM3413

的CE型、BMS1788的DF型、BMS1248的BE型可望作為青格里絨山羊絨細度、絨長度、產絨量、含絨率的候選標記的優勢基因型[10]。本研究選取了10個微衛星位點在西藏絨山羊進行多態性分析，其中BMS6438位點在西藏絨山羊中未發現多態性，與古麗尼沙·吐拉甫在新疆山羊與青格里絨山羊的多態性分析結果相同，說明BMS6438微衛星位點在這3個品種中不存在多態性，在其他品種是否存在，有待進一步研究。具有多態性的9個微衛星位點的基因型與西藏絨山羊部分經濟性狀的關聯性分析發現，BM3033的基因型 6、BMS1248的基因型 1和BM3033的基因型 6、BMS1248的基因型 2和BM3033的基因型6、BMS1788的基因型3、BM3413的基因型1和基因型2可分別作為西藏絨山羊體長、體高、胸圍、絨長、毛長的候選標記優勢基因型。這與古麗尼沙·吐拉甫在新疆山羊的研究結果存在相似性，也有不同之處，導致出現不同結果的原因可能是采樣本身、生產數據的測量、儀器設備等方面的原因，但從動物起源進化和分類角度分析，出現不同結果的主要原因是不同品種之間與生態環境因素的差異。

表3 微衛星位點的不同基因型與經濟性狀關聯分析Table 3 Correlation analysis between different genotypes and economic traits ofmicrosatellite loci

本試驗中選取了部分經濟性狀進行與微衛星基因型進行關聯分析，初步得到的西藏絨山羊經濟形狀候選標記的優勢基因型，為西藏絨山羊分子標記輔助選擇提供參考依據。