低鉀脅迫下烤煙苗期葉片的差異蛋白及其生物信息學分析

朱崇文，戴林建，肖澤凡，鐘軍

湖南農業大學農學院煙草系，長沙市芙蓉區農大路1號 410128

鉀是植物生長發育所必須的礦質營養元素，參與植物體內碳、氮代謝等多項生命活動[1]。煙草是典型的喜鉀作物，鉀也是煙草吸收最多的礦質元素，充足的鉀含量是煙葉優質的前提之一[2]。并對提高煙葉的燃燒性，改善煙葉品質，減少焦油產生具有重要作用[3]。

蛋白質組學是以蛋白質組為對象，研究蛋白質的表達水平，翻譯后修飾的種類，蛋白與蛋白的相互作用等，從整體水平研究蛋白質的組成和調控規律[4]。周利等利用雙向電泳結合質譜技術，對無菌培養四周的煙苗進行低鉀處理，分別在低鉀處理12 h、24 h和48 h檢測到9種蛋白上調、10種蛋白上調和12種蛋白下調。其差異蛋白以光合作用相關蛋白質和與應激響應相關的蛋白質為最多[5]。

label-free定量蛋白質組學技術可基于一級譜圖母離子強度或肽段匹配的二級譜圖數目為基礎的蛋白定量分析方法[6]。理論上，label-free可用于任何樣本的蛋白質定量分析，可對不同來源的同一樣本的定量數據進行互相比較，且數據移植性高[4]，得到廣泛應用。宋浩等通過label-free蛋白定量技術研究了煙草青枯病菌侵染煙草后，其蛋白質應答情況，在致病菌株和非致病菌株中分別鑒定出15個致病性菌株中特有和287個非致病性菌株中特有的蛋白。這些差異表達蛋白主要定位于細胞外或與糖代謝相關[7]。阮土娣等利用液相色譜串聯質譜和label-free定量技術，研究里氏木霉中磷酸化蛋白在阻遏條件、誘導條件和中性條件下的表達差異，分別在誘導對比阻遏條件、誘導對比中性條件、阻遏對比中性條件中發現差異蛋白90、61和90個。這些差異蛋白可以分為鋅指蛋白、ATP結合蛋白、具有N-乙酰化轉移酶活性的蛋白以及具有氧化還原酶活性的蛋白[8]。

本研究以烤煙高鉀品系為材料，通過控制營養液中鉀濃度建立低鉀模型，采用label-free蛋白質組學技術定量分析蛋白質表達情況。生物信息學方法分析鑒定與煙草葉片低鉀相關的差異表達蛋白質，探究差異蛋白的定位、功能以及參與的通路途徑等，為煙草品種選育與栽培調控提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

烤煙高鉀品系HKDN-5為湖南農業大學戴林建[9]等自主培育。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計與樣品采集

試驗設計詳見參考文獻10。

待煙苗生長到5-6片葉時，選取長勢正常的4-5株植株，取其葉片制成混合樣，每組取3個重復樣。同時用鋁箔紙包裝好，編號，裝入布袋，迅速投入液氮罐中保存備用。

1.2.2 蛋白質制備及濃度測定

取適量冷凍保存的煙草鮮嫩葉片，采用苯酚法[11]提取煙葉蛋白質，并用Bradford[12]法進行蛋白質含量測定。

1.2.3 蛋白質酶解、nano-HPLC-MS/MS分析及其生物信息學數據分析

蛋白質酶解方法、HPLC-MS/MS分析方法及其生物信息學數據分析詳見參考文獻10。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳結果

圖1為兩組葉片蛋白質的SDS-PAGE分離后考染圖，兩組的細胞總蛋白質分布均勻，均無極高豐度的蛋白質，符合色譜質譜檢測對蛋白豐度的要求，兩者也具有相似的蛋白條帶。

圖1 葉片蛋白質SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophorogram of leaf proteins

2.2 差異表達蛋白質鑒定及統計

經質譜檢測和數據庫查詢，烤煙高鉀品系HKDN-5低鉀對比正常鉀組的苗期葉片蛋白質Group為3511個，蛋白質ID為11419個。在其中選取差異倍數為1.5以上，且有顯著性意義（P<0.05）的差異表達蛋白質數量進行統計，可知低鉀脅迫下的差異表達蛋白總數有101個，其中下調的蛋白點有52個，上調的有49個（圖2）。

圖2 差異蛋白質火山圖Fig.2 Volcano plot of differential proteins

由表1可知，上調蛋白主要集中在[1.5-2]差異倍數間，占上調蛋白總數的53.1%，下調蛋白同樣主要集中在[1.5-2]差異倍數間，占下調蛋白總數的59.6%。總的來說，差異表達蛋白質主要集中在[1.5-4]差異倍數間，占總差異蛋白質的90.1%，差異倍數大于2的差異表達蛋白質為44個，占差異表達蛋白質總數的43.6%。

表1 差異蛋白質統計表Tab.1 Statistics table of differential proteins

2.3 生物信息學分析

2.3.1 差異表達蛋白質的GO注釋

由GO注釋（表2）可知，差異蛋白質主要定位在細胞組分、細胞器組分和膜結構中，占差異蛋白總數的91%；具有參與水解酶活性、離子結合和轉移酶活性的差異蛋白質數量最多，占差異蛋白總數的84%；差異蛋白參與細胞代謝、有機物代謝、單組織代謝、單組織細胞過程和基本代謝過程的數量最多，占差異蛋白總數的70%。

表2 差異表達蛋白質GO注釋表Tab.2 GO annotation table of differentially expressed proteins

2.3.2 差異表達蛋白質的KOG注釋

如圖3所示，該圖表示低鉀脅迫中具有不同功能的差異表達蛋白質的數量統計，功能蛋白可分為17種，分別為A、C、E、G、H、I、J、M、O、P、Q、R、S、T、U、V和Z等。差異表達蛋白質中數量最多的為G類相關蛋白，數量最少的為H、I、Q、T和V類蛋白（均只有一個）。其中上調蛋白數量最多的為G類蛋白，下調蛋白數量最多的為O類蛋白，具有H、I和V功能相關的只有上調蛋白，具有A、P、Q和T功能相關的只有下調蛋白。說明在低鉀脅迫下，關于碳水化合物運輸和代謝相關的蛋白（G類）的上調表達在煙葉正常生長發育過程中發揮著關鍵性作用。

圖3 差異蛋白質KOG分類圖Fig.3 KOG classification map of differential proteins

表3為具有KOG號且差異倍數≥2的差異蛋白質鑒定表，由表可以更清楚地了解到蛋白質的名稱及其具有的KOG功能，以及差異蛋白酶在煙葉生長發育過程中可能發揮的作用。據表3可知，有13個蛋白（7個上調，6個下調）參與到G、E、P和I等代謝相關途徑；有2個蛋白（均為下調）參與到A和J等遺傳信息處理相關過程；有9個蛋白（6個上調，3個下調）參與到M和O等細胞和環境信息處理相關過程；有6個蛋白（均為上調）參與到R和S等其他過程。

2.3.3 差異表達蛋白質的KEGG pathway分析

根據差異表達蛋白質的KEGG pathway分析可知，差異表達蛋白質共參與51條通路途徑。其中包括24條代謝通路，占總通路途徑的47.1%；9條合成途徑通路，占總通路途徑的17.6%；3條降解途徑，占總通路的5.9%。差異蛋白質參與具有顯著性差異的途徑主要有：抗壞血酸與醛酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、淀粉與蔗糖代謝、氨基糖與核苷酸糖代謝、甘油酯代謝、二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝和氨基酸生物合成等相關通路。而這些通路途徑基本都與物質代謝相關，說明與正常鉀組相比，低鉀脅迫下的差異蛋白主要參與物質代謝途徑。

3 討論

植物在高鉀低鉀不同處理下，產生的差異蛋白及其參與的生物學途徑不盡相同。關于高鉀處理下烤煙苗期葉片差異蛋白的表達，本課題組已有論文發表（見2019年河南農業科學第5期）；關于低鉀脅迫下烤煙苗期根系差異蛋白的表達，課題組也已有論文發表（見2019年中國煙草科學第1期）；本文只討論低鉀脅迫下烤煙苗期葉片差異蛋白的表達及其參與的生物學途徑。

3.1 與代謝相關的差異蛋白質

有研究表明煙草[5,13]、棉花[14]、苧麻[15]等植物在經過低鉀處理后，產生的差異蛋白中與代謝過程相關的主要包括氨基酸氨基轉移酶、ATP合成酶、已糖激酶、磷酸酶類等。

本試驗鑒定中，同樣發現己糖激酶和肌醇單磷酸酶等發生上調差異表達，紫色酸性磷酸酶和絲氨酸羥甲基轉移酶等發生下調差異表達。此外，還發現β-半乳糖苷酶和銅轉運體蛋白等下調較為明顯。這兩類蛋白的差異表達可能與鉀處理時間或烤煙品系的特殊性相關。

己糖激酶在試驗中上調明顯，該酶為淀粉與蔗糖代謝途徑中的關鍵酶，具有催化己糖磷酸化的作用，其催化反應構成植物和其它有機體代謝活動的重要調控步驟[16]。己糖激酶還參與植物的糖感受和糖信號轉導過程[17]，同時該酶既可參與葡萄糖抑制光合作用和糖酵解相關基因的調控，還在光合組織中起調節光合作用、生長發育和衰老的調節酶的作用[18]。

研究表明，紫色酸性磷酸酶能夠在低磷脅迫下幫助植物體將不能吸收的有機磷轉換成無機磷，以緩解植物缺磷狀況[19]，而在低鉀中，該酶的下調表達，可能是因為在缺鉀環境下，與鉀離子吸收轉運等方面關系不大的蛋白會下調表達，助于維持內環境穩定。絲氨酸羥甲基轉移酶普遍存在于真核生物中，在高等植物的一碳代謝和光呼吸中起著非常重要的作用[20]。此外，該酶是植物體的光呼吸作用中關鍵酶之一，植物體中缺乏絲氨酸羥甲基轉移酶，則會由于不能發生產氧的光合作用，而導致植物體生長被嚴重延遲[21]。低鉀營養下，該酶的下調表達便是植物生長緩慢，植株矮小的原因之一。

β-半乳糖苷酶又名乳糖酶，是一種廣泛存在于動植物及微生物中的多功能酶。它不但能夠水解乳糖，還具有半乳糖苷轉移活性[22]。研究表明β-半乳糖苷酶的功能團可能不利于植物體的生長發育，特別是葉片的生長，所以該酶發生下調表達。銅轉運蛋白不僅參與銅的細胞攝取，而且在其它重金屬離子的攝取過程中也發揮重要作用[23]。它是一種定位于細胞膜的跨膜轉運蛋白，除了轉運銅離子外，也可以轉運其他金屬離子，只是能不能轉運鉀離子還尚未可知，需要進一步研究。

3.2 與應激反應相關的差異蛋白質

低鉀脅迫在分子水平上的響應，與其他非生物刺激的響應有相同之處，不同的逆境刺激響應在分子水平的轉錄調控中可能具有相同的調控方式和調控過程[24]。研究發現煙草[5,13]、棉花[14]、苧麻[15]等植物在低鉀脅迫下的差異蛋白中與應激反應相關的主要包括超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、轉錄因子等。

在本研究鑒定中，主要為谷胱甘肽S-轉移酶和膜聯蛋白等酶發生上調表達，50S核糖體蛋白、蛋白酶體亞基和蛋氨酸亞砜還原酶等酶發生下調表達。鑒定的差異蛋白存在不同，同樣可能與鉀處理的時間不同或與烤煙高鉀品系的特殊性相關，為烤煙高鉀品系的差異蛋白質組學研究鑒定基礎。

谷胱甘肽S-轉移酶的上調表達可作為植物應對逆境壓力的標志之一[25]，在植物初級和次級代謝、誘導脅迫和信號轉導中具有重要功能[26]。該酶在代謝和解毒方面發揮重要作用[27]，表現在使內源性或外源性毒素失活從而發揮解毒的作用[28]。該酶也可以參與細胞內物質的運輸和儲存、細胞信號通路的調節[29]等途徑，在植物抗逆境脅迫以及維持植物的新陳代謝等方面發揮著重要作用[30]。其上調表達可能與煙草為在緩解鉀缺失造成的外界環境壓力問題，介于該酶的作用，推測該酶可能與鉀離子的運輸、儲存及鉀吸收轉運的信號傳遞等途徑有關。

蛋氨酸亞砜還原酶是目前唯一確定的蛋白質蛋氨酸亞砜殘基特征性還原酶，能夠將蛋氨酸亞砜還原為蛋氨酸，起到調節蛋白質的功能、調控相關信號通路、修復氧化損傷蛋白、防止氧化應激等作用[31]。雖然這些蛋白與植物體內蛋白的生理方面息息相關，但是并沒有直接參與植物體生長發育或應激反應過程。

3.3 其他差異蛋白質

除了與應激和代謝相關的差異蛋白中，試驗鑒定的主要有幾丁質酶、羥酰基谷胱甘肽水解酶和D-甘油酸3-激酶等發生差異表達，且均為發生上調。幾丁質酶是廣泛存在于微生物和植物體內的一類蛋白質，能水解真菌細胞壁中的幾丁質，從而抑制真菌的生長增殖，提高植物的抗真菌能力，是一類重要的病程相關蛋白[32]。該酶是植物重要的防衛因子，在植物生長發育、抗逆和防御反應中發揮重要作用[33]。羥酰基谷胱甘肽水解酶參與節間伸長，與激素調節相關，可以通過與其他相關酶的交互作用，協調作用促進莖的伸長[34]。該酶的上調表達，無疑是在低鉀這種逆境下，促進植物體生長的方式之一。

在本試驗鑒定的蛋白中，并沒有發現與鉀轉運體或離子通道直接相關的蛋白，推測可能的原因有：煙葉苗期期間，此類蛋白的差異并不明顯；此類蛋白主要作用在根系中；與烤煙高鉀品系的特殊性相關。具體的原因有待進一步研究。

4 結論

本研究通過label-free定量蛋白質組學技術對低鉀脅迫下烤煙苗期葉片差異表達蛋白分析鑒定，大部分差異表達蛋白定位在細胞組分、細胞器組分和膜結構中，具有水解酶活性、離子結合和轉移酶活性等分子功能，參與細胞代謝、有機物代謝、單組織代謝、單組織細胞過程和基本代謝過程等生物過程。具有碳水化合物運輸和代謝功能的差異表達蛋白數量最多，且主要參與物質代謝相關途徑。大部分差異蛋白質發生上調表達，為煙葉的抗逆生長等方面提供一定的保障。