烤煙成熟期煙葉木質素合成關鍵酶基因的轉錄分析

高婭北，孫曙光，王勝雷，陳二龍，楊曉亮，孫占偉，宋朝鵬*

1 河南農業大學煙草學院，河南 鄭州 450002；

2 湖北中煙工業有限責任公司，湖北 武漢 430040；

3 福建省煙草公司，福建 福州 350003；

4 河南中煙工業有限責任公司，河南 鄭州 450016

木質素作為植物細胞壁的主要組成成分，與植物的抗倒伏能力、抗病性以及抗旱性等多種在生長發育過程中所形成的抗性特征密切相關[1-3]，但在卷煙原料的生產上，過高的木質素含量會對卷煙產品燃吸時的感官質量以及安全性方面產生不利影響[4]。而成熟期是植物生長發育的關鍵時期，因此，探究成熟期烤煙木質素代謝機理可以合理調控煙葉的木質素含量，對促進優質煙葉的生產以及優質卷煙產品的生產具有重要意義。目前，國內外學者對于木質素的合成途徑進行了大量研究，主要集中于2個方面，一是苯丙烷類代謝途徑，即木質素與其他酚類物質合成所用的公共路徑，主要包括PAL（苯丙氨酸解氨酶）、C4H（肉桂酸4-羥化酶）、4CL（4-香豆酰CoA連接酶）3種關鍵酶類，他們的基因表達量對木質素及其他酚類物質的生物合成及含量高低有重要影響[5-7]；二是木質素單體合成的特異路徑，主要包括上游的C3H（香豆酸3-羥化酶）、HCT（莽草酸羥基肉桂酰轉移酶）、COMT（咖啡酸O-甲基轉移酶）、CCoAOMT（咖啡酰CoA-O-甲基轉移酶）和F5H（阿魏酸5-羥基化酶）以及下游的CCR（羥基肉桂酰CoA還原酶）、CAD（肉桂酸脫氫酶）和PAO（多胺氧化酶），這些合成酶基因表達量的高低不僅影響木質素含量的高低，還對其單體的組成有較大影響[8-11]。但關于煙草木質素合成路徑的研究多集中于木質素與其他酚類物質合成的共用路徑以及合成特異途徑中的少數幾個合成關鍵酶方面[12-14]，缺乏對其的合成路徑進行全面系統深入的研究，對于烤煙煙葉成熟過程中木質素合成積累的關鍵時期及合成關鍵酶基因尚不清楚。本研究以K326為材料，測定煙株成熟期煙葉生長發育過程的中部葉片硬度、葉片組織結構和木質素含量，應用qRT-PCR（熒光定量PCR）方法分析木質素合成路徑上的12個相關合成酶基因PAL、C4H、4CL1、4CL2、C3H、F5H1、HCT1、CCR1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2和PAO1的表達量，探究烤煙木質素在成熟期的合成規律、合成積累的關鍵點及其關鍵酶基因表達規律，旨在系統探究煙葉木質素合成的分子調控機制，為烤煙品種選育及優質煙葉生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

田間試驗于2018年在河南省洛陽市洛寧縣煙草科技示范基地（地處東經111°38＇，北緯34°26＇）進行。試驗田植煙土壤為黃棕壤，肥力中等，0～20 cm土層含有機質13.54 g/kg、堿解氮75.16 mg/kg、速效磷9.16 mg/kg和速效鉀164.38 mg/kg，土壤pH 7.26。

選用K326為試驗品種。按照當地優質煙葉生產技術規范種植管理，行距110 cm，株距55 cm，單株留葉數18～20片，煙田施氮量為72 kg/hm2，使用煙草專用復合肥，N : P2O5: K2O=1 : 1 : 2。在打頂后當天、10 d、20 d、30 d、40 d和50 d進行取樣（打頂后30天中部葉達到適熟狀態），采集生長情況正常、葉片完整且朝向一致的烤煙中部葉（10～12葉位）20片，其中10片在采后立即去除主脈，混合第6至第7支脈葉肉樣品10 g左右，用錫紙和紗布包裹后放入液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱中進行保存，用于煙葉木質素含量和相關合成酶基因表達量的測定，其余鮮煙葉用于葉片硬度及組織結構測定。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 葉片硬度和組織結構測定。

煙葉硬度測定參照蔣博文等[15]的方法，采用質構儀進行煙葉硬度測定；煙葉組織結構測定參照宋朝鵬等[16]的方法，利用8 mm打孔器分別在打頂后當天、30天和50天的葉片中部進行取樣，采用常規石蠟包埋染色處理，制片，在Olympus光學顯微鏡下利用測微尺對葉片、上下表皮、海綿組織、柵欄組織厚度進行測量[17]。

1.2.2 木質素含量測定方法

將新鮮煙葉樣品在80 ℃下烘干至恒重，將干燥后的樣品磨碎過40目篩，稱取5 mg于10 ml玻璃試管中，采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的木質素含量微量法試劑盒進行煙葉木質素含量測定。

1.2.3 木質素相關合成酶基因表達量分析

在NCBI的Gene數據庫（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索煙草木質素合成相關酶的編碼基因，分別獲得普通煙草PAL、C4H、4CL1、4CL2、C3H、F5H、HCT、CCR、CCoAOMT、COMT、CAD和PAO蛋白的編碼區序列（圖1）。將獲得的每個基因家族序列進行多序列比對，通過SMART（http://coot.embl-heidelberg.de/SMART）在線軟件預測基因的保守區域，利用Primer 5.0在基因的5'保守區域設計特異qRT-PCR引物（表1）。

采用Trizol法提取煙草樣品中總RNA，反轉錄合成cDNA[18]。利用QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，Germany）在LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進行qRT-PCR。選用煙草核糖體蛋白編碼基因NtL25作為內參基因，反應程序為：95 ℃30 s，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，40 個循環。實驗結果采用 2-ΔΔCt算法進行分析，確定各基因的相對表達量[19]。試驗設置3次重復。

1.3 數據分析

運用Microsoft Excel 2010進行試驗結果統計整理，運用Origin 2018進行圖片繪制，運用SPSS 22進行方差分析及通徑分析。

表1 煙草木質素合成相關酶基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence of lignin-related synthetase gene in tobacco leaves

續表1

圖1 植物木質素生物合成路徑（由文獻[20-21]修改而成）Fig.1 Biosynthesis pathway of lignin in plants (modification based on[20-21])

2 結果

2.1 K326煙葉硬度和組織結構變化

由表2可見，煙葉硬度在打頂后的不同時期間差異顯著，表現為打頂后先升高而后降低的變化趨勢。煙葉在打頂后不同生長發育時期葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度以及海綿組織厚度之間存在著不同程度的差異，其中葉片厚度、柵欄組織厚度和葉片緊密度隨煙葉打頂后天數的增加而顯著減小，煙葉上表皮厚度和海綿組織厚度為打頂后30 d顯著高于其他兩時期，下表皮厚度則表現為打頂后30 d顯著低于其他兩時期；可見煙葉組織結構會隨煙葉打頂后的生長發育發生明顯的變化，各時期間差異明顯。

表2 不同打頂時期煙葉硬度和組織結構的變化Tab.2 Changes in hardness and tissue structure of tobacco leaves at different topping stages

2.2 煙葉木質素含量變化

由圖2可見，不同時期間煙葉木質素含量具有顯著差異，在打頂后的成熟階段，煙葉木質素含量呈現出先增加后降低的變化趨勢，在成熟時（打頂后30天）含量達到最大值，而后隨成熟度進一步增加含量略有降低，這也與煙葉硬度的變化表現出較為一致的規律。表明成熟期煙葉木質素含量變化較大，是其合成積累的重要時期。

2.3 木質素相關合成酶基因的qRT-PCR表達量

由圖3可見，利用qRT-PCR技術對進入成熟期各發育階段的煙葉中木質素合成上游、中游和下游各相關酶基因的相對表達量進行分析，結果表明各基因在煙葉組織中均有表達，但相對表達量各異。煙葉木質素相關合成酶基因表達量除局部波動外基本都呈現出先上調而后下調的變化趨勢，在打頂后30 d其基因表達量最高，說明打頂后的煙葉成熟階段是木質素合成積累的關鍵調控時期。

PAL、C4H、4CL1和4CL2基因為煙葉苯丙氨酸代謝途徑中調控木質素和其他物質合成的共用相關酶基因[22]，屬于煙葉木質素合成途徑上游的相關酶基因。在本研究中，PAL、C4H、4CL1基因在成熟過程中基因表達量前后差異較明顯，且均在打頂后30 d基因表達量最高，而后迅速下調；PAL基因相對表達量呈先上調后下調的單峰曲線變化趨勢；C4H在打頂后20 d略有下調而后迅速上調；4CL1在打頂后表達量呈逐漸下調的趨勢，但前后差異不顯著；而4CL2基因表達量在成熟過程中前后變化不明顯；說明在木質素合成的苯丙氨酸代謝途徑中，可能是PAL、C4H、4CL1基因所發揮的調控作用較大。

C3H、HCT1、COMT1、CCoAOMT5和F5H1是調控煙葉中木質素單體合成特異路徑上游的相關酶基因。在本研究中CCoAOMT5、COMT1和F5H1基因的相對表達量在煙葉成熟過程中前后差異較大，且除個別時期外，其基因表達量均呈先上調后下調的單峰曲線變化趨勢，在打頂后30 d其基因表達量最高；C3H和HCT1基因表達量在煙葉成熟過程中變化較??；說明在木質素單體合成的特異途徑上游中，可能CCoAOMT5、COMT1和F5H1基因所發揮的調控作用較大。

CCR1、CAD2和PAO1基因是調控煙葉木質素單體合成特異路徑下游的相關酶基因。在本研究中這些基因的表達量在煙葉成熟期均變化較大，且呈先增加，在打頂后30 d達到最大而后迅速下調的單峰變化趨勢，說明這些調控木質素單體合成的下游相關酶基因可能對木質素的合成調控作用較大。

結合木質素合成的規律，發現PAL、C4H、4CL1、CCR1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、PAO1和F5H1基因表達規律與木質素合成規律較為一致，其中PAL、C4H、CCR1、CAD2和PAO1的表達量變化較大，我們推測這些基因可能在煙葉打頂后成熟期生長發育階段的木質素代謝途徑中發揮關鍵作用。

2.4 木質素含量與其合成相關酶基因表達量的相關性分析

由表3分析表明，木質素含量與PAL、C4H、CCR1、CAD2和PAO1基因表達量呈極顯著正相關關系，與4CL1、CCoAOMT5、COMT1、F5H1基因表達量呈顯著正相關關系，與4CL2、C3H和HCT1基因表達量相關性不顯著；PAL、C4H、4CL1、F5H1、HCT1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、CCR1和PAO1基因的表達有明顯的協同作用，相互之間的相關性達到顯著或是極顯著的關系，其表達量的變化趨勢也較為相似。4CL2和C3H基因的表達量變化趨勢與其他基因相差較大，其與木質素含量之間相關系數較小，且基因表達量與木質素含量之間為負相關關系。

2.5 木質素含量與其合成相關酶基因表達量的通徑分析

由表4分析表明，煙葉木質素合成相關酶基因表達量對煙葉木質素含量的影響程度相差較大，除4CL2和C3H的基因表達量對煙葉木質素含量為負影響外，其他基因均為正影響。其中對木質素含量影響較大的的是PAL、C4H、PAO1、CAD2和CCR1，直接通徑系數分別為0.24、0.19、0.19、0.17和0.16，且PAL、C4H和PAO1的間接通徑系數也較大，表明其他基因通過PAL、C4H和PAO1對木質素含量均有較大的間接影響；雖然4CL1的間接通徑系數較小，表明其他基因通過4CL1對煙葉木質素含量的間接影響略小，但4CL1基因表達量對木質素含量有相對較大的直接影響，直接通徑系數為0.12；CCoAOMT5、COMT1和F5H1的基因表達量對木質素含量影響差別不大。HCT1和4CL2對木質素含量的影響較小，其中影響最小的是4CL2的表達量，直接通徑系數為-0.03?？芍绊懩举|素含量變化的主要因素為PAL、C4H、PAO1、CAD2和CCR1的基因表達量。

圖3 煙葉成熟期木質素合成關鍵酶基因表達Fig.3 Gene expression of lignin biosynthesis in tobacco leaves at maturity stage

表3 木質素含量與合成相關酶基因表達量的相關性分析Tab.3 Correlation analysis between lignin content and expression quantity of lignin synthase-related genes

表4 木質素含量與合成相關酶基因表達量的通徑分析Tab.4 Path analysis of lignin content and expression quantity of lignin synthase-related genes

3 討論

木質素作為植物的細胞壁物質，其與纖維素結合后可使植物細胞壁具有一定的硬度和強度，其含量變化可改變植物組織硬度，影響組織結構的發育，從而使植物具有一定的抗倒伏及抗病能力[23-24]。成熟期是木質素代謝的關鍵時期，本研究表明各品種煙葉木質素含量隨打頂天數的增加呈先增加后降低的變化趨勢，打頂后30天達到峰值，隨后煙葉衰老程度增加木質素含量降低，這也與玉米等作物葉片成熟過程中木質素含量的變化規律相一致[25-26]，也可能與隨著煙葉的衰老煙葉細胞壁物質逐漸降解有關[27]；從煙葉在打頂后的硬度變化和組織結構發育情況來看，煙葉硬度先增加后降低，這可能與在生長發育過程中的木質素含量變化有關，這也與李玉菲[28]認為的木質素合成旺盛是造成煙葉偏硬的研究結果相一致；閆克玉等[29]研究認為煙葉木質素含量隨煙葉厚度的增加而減少，本研究呈現相似的研究結果，打頂30d后煙葉厚度減小可能是由于隨煙葉衰老，煙葉海綿組織以及柵欄組織逐漸萎縮引起的。

研究表明PAL、C4H、4CL1、4CL2、F5H1、HCT1、C3H、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、CCR1和PAO1基因在木質素的合成過程中發揮有重要的調控作用[30]，其表達量的大小與植物木質素合成量的多少密切相關[31-33]。本研究結果發現，PAL、C4H、4CL1、HCT1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、F5H1、CCR1和PAO1基因表達量基本呈單峰變化趨勢，隨成熟度的增加基因表達呈上調趨勢，在打頂后30天及適熟時達到最大值，而后隨葉片衰老表達量降低，這與黃杰恒等[34]的研究結果相一致，說明成熟期是煙葉木質素合成的關鍵時期；4CL2基因表達量在成熟期變化規律不明顯，前后波動較大，與4CL1表達量變化趨勢差別較大，這表明4CL1基因對木質素合成的調控作用較大，4CL2基因對木質素合成的調控作用不大；C3H基因表達量在打頂后初期呈下調趨勢，可能受打頂后植物體內生理生化反應發生變化所影響，隨后變化不明顯，說明C3H表達量可能對烤煙葉片木質素含量影響不明顯，這也與胡丹等[35]的研究結果一致。

相關分析及通徑分析表明，PAL、C4H、4CL1、HCT1、CCoAOMT5、F5H1和PAO1基因在與煙葉木質素含量的相關系數及直接通徑系數較大，表明他們的相對表達量對煙葉木質素的含量變化影響較大；C3H的基因表達量對木質素合成會產生負向影響，但直接通徑系數較小，為-0.10，說明它們對烤煙葉片木質素的合成具有負調控作用，如果在一定范圍內降低其表達量，對木質素的含量變化可能不會造成影響，但對于抑制其表達對烤煙煙葉木質素合成的影響還需進一步研究。4CL1與4CL2為植物4CL家族基因，在本研究中，4CL2對煙葉木質素的合成呈負向影響且直接通徑系數較小，這也與HU等[36]的研究結果一致，是由于二者的差異表達從而調控不同苯丙氨酸代謝途徑代謝產物的生物合成，4CL1主要參與木質素的生物合成而4CL2主要參與類黃酮等物質的生物合成所引起的。

4 結論

在烤煙中部葉打頂后進入成熟階段，煙葉木質素含量呈先增加后降低的變化規律，打頂后0-30天是其合成積累的關鍵時期，在葉片成熟時（打頂后30天）其含量最高；研究其基因表達模式發現，PAL、C4H、CCR1、CAD2和PAO1基因對煙葉木質素合成積累量的影響較大（p<0.01，r=0.93,0.90,0.91,0.90,0.89；P=0.24,0.19,0.16,0.17,0.19），是烤煙中部葉木質素合成積累過程中的關鍵調控基因。本研究從分子生物學角度探究了不同品種烤煙中部葉成熟期葉片木質素合成及關鍵合成酶基因表達的規律，為烤煙木質素代謝的分子作用機理提供了理論基礎。