硫酸軟骨素眼用膜劑含量測定方法的建立及質量研究

崔穎 陳繼成 陳紅艷

【摘要】目的：建立硫酸軟骨素眼用膜劑的含量測定方法并對其進行質量研究。方法：優化間苯三酚顯色法測定硫酸軟骨素含量，并利用間苯三酚顯色法測定眼用膜劑中硫酸軟骨素含量;評價眼用膜劑的外觀、性狀、pH及重量差異;采用漿法評價其體外釋藥情況;利用Draize眼刺激實驗的改良方法評價眼用膜劑的刺激性;并采用控制變量法考察其穩定性。結果：間苯三酚顯色法最佳條件：濃鹽酸濃度4mol/L，用量，顯色劑用量，煮沸時間，檢測波長，結果顯示硫酸軟骨素在范圍內線性關系良好，精密度良好。測定硫酸軟骨素眼用膜劑含藥量為0474mg/片，無色透明、柔韌性良好、平整無泡、厚度適宜、pH70。平均重量為372mg;體外釋放結果顯示具有一定的緩釋作用且無眼部刺激性;但眼用膜劑高溫、高濕條件色澤變黃，含藥量改變。結論：間苯三酚顯色法可用于測定硫酸軟骨素眼用膜劑含量;自制硫酸軟骨素眼用膜劑外觀，重量差異符合規定，無眼刺激性，pH符合眼用制劑標準;但對高溫高濕不穩定。

【關鍵詞】硫酸軟骨素;眼用膜劑;間苯三酚法;含量測定;質量評價

【中圖分類號】R25621

【文獻標識碼】A

【文章編號】2095-6851（2019）10-040-01

硫酸軟骨素可用于治療角膜炎、角膜潰瘍、化學灼傷及熱灼傷等角膜損傷。眼用膜劑的應用可解決普通的硫酸軟骨素滴眼液的生物利用度較低的問題。本研究在前期實驗的基礎上進一步建立自制硫酸軟骨素眼用膜劑的含量測定方法，并對眼用膜劑的質量進行考察。旨在為該類制劑的研究提供更好的理論基礎及實驗參考。

1 儀器與材料

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;超聲波清洗器（深圳市潔盟超聲波清洗機有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義市英峪予華儀器廠）;T6紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;BX1300綜合藥品穩定性試驗箱（上海佐誠實驗儀器有限公司）;RCZ-8B溶出試驗儀（天津市精拓儀器科技有限公司）;硫酸軟骨素（豐足生物有限公司）;聚乙烯醇17-88（天津市開發區樂泰化工有限公司）;間苯三酚（天津市光復精細化工研究所）;冰乙酸（天津市福晨化學試劑廠）;甘油（沈陽市華東試劑廠）;注射用水（實驗室自制）;所有試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 硫酸軟骨素眼用膜劑的制備

稱取300gPVA17-88，用25ml注射用水浸泡24h，70℃恒溫水浴使之溶解。加入甘油200g和硫酸軟骨素150g，攪拌使形成均勻膜漿，將膜漿于70℃恒溫超聲脫氣20min，將膜漿傾倒于經過預處理的玻璃板上，使膜漿在玻璃板上均勻鋪展，并具有一定厚度。將玻璃板置于60℃烘箱中干燥1h，脫膜，在紫外燈下滅菌30 min。將膜劑切割成1cm*05cm的單劑量膜劑。

2.2 間苯三酚顯色法的建立

硫酸軟骨素為酸性粘多糖類物質，在酸性條件下加熱水解，可斷裂糖苷鍵，水解產物能夠與間苯三酚反應而顯粉紅色，且溶液顏色與硫酸軟骨素濃度在一定范圍內符合Lambert-beer定律[1]。故選用該法進行含量測定。

2.2.1 溶液的配制

間苯三酚溶液的配制：稱取250g間苯三酚，用95%乙醇溶液溶解并定容至50mL，得濃度為50mg/mL的間苯三酚乙醇溶液。置入冰箱冷藏待用。

顯色劑的配制：分別吸取間苯三酚乙醇溶液1mL、冰醋酸3mL、4mol/L鹽酸200mL，混勻即得，現用現配。

硫酸軟骨素溶液的配制：精密稱取0500g硫酸軟骨素，純化水溶解并定容至50mL，得濃度為10mg/mL的硫酸軟骨素溶液。

空白輔料溶液的配制：取眼用膜劑處方中除主藥以外的輔料，純化水溶解并定容至50mL，即得。

2.2.2 檢測波長的選擇

分別吸取0mL、010mL、020mL、030mL、040mL硫酸軟骨素溶液及空白輔料溶液04mL于10mL具塞試管中，分別加入300mL顯色劑，用冰醋酸定容，置于100℃沸水中30min。再轉移置冰水浴中5min，于400nm～800nm處掃描紫外光譜。結果硫酸軟骨素水解液在400～800nm波長內有兩處吸收峰，分別為44800nm、54450nm。54450nm處吸收峰隨硫酸軟骨素濃度的增大而增大，且空白輔料無干擾。故選擇54450nm處作為檢測波長。

2.2.3 鹽酸濃度的考察

分別用濃度為2mol/L、4mol/L、6mol/L、8mol/L、10mol/L的鹽酸溶液按顯色劑配制操作，按222方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結果吸光度變化不明顯，當鹽酸濃度為4mol/L時，吸光度較大，且干擾較小。故選擇鹽酸濃度為4mol/L。

2.2.4 鹽酸用量的考察

分別吸取4mol/L鹽酸溶液100mL、200mL、300mL、400mL、500mL配制顯色劑，按222方法方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結果水解液的吸光度隨鹽酸用量的增大而增大，但是雜質干擾也變大。鹽酸用量為100mL時，處吸光度較大且雜質干擾較小。故配制顯色劑的鹽酸溶液的適宜用量為100mL。

2.2.5 顯色劑用量的考察

根據最適鹽酸濃度及用量配制顯色劑，分別用100mL、300mL、500mL的顯色劑對硫酸軟骨素進行水解，按222方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結果當顯色劑用量為300mL時，吸光度最大，且雜質吸收較小。故顯色劑的適宜用量為300mL。

2.2.6 沸水浴時間的考察

分別考察沸水浴時間15min、30min、45min、60min、90min、120min，按222方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結果隨著沸水浴時間的延長，吸光度無明顯變化，而雜質干擾明顯增大。沸水浴時間為30min時，吸光度較大且雜質干擾小。故選擇沸水浴時間為30min。

2.2.7 標準曲線的繪制

分別吸取硫酸軟骨素溶液010mL、020mL、030mL、040mL、050mL、060mL、070mL，按最佳水解條件測定硫酸軟骨素水解液吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，進行直線回歸，得回歸方程為：y=04520x+01210（R2=09995），線性關系良好。

2.2.8 精密度

吸取硫酸軟骨素溶液020mL，按按最佳水解條件測定硫酸軟骨素水解液吸光度，每隔兩小時測定一次，連續測定5次作為日內精密度;同法連續測定5天作為日間精密度。結果日內精密度良好，RSD<1%;日間精密度不佳，RSD接近5%，故本法應當天樣品當天測定。

2.3 眼用膜劑的質量研究

2.3.1 性狀、pH、重量差異及含藥量測定

將21項下制得眼用膜劑按《中國藥典》（2015版）第四部膜劑項下，考察膜劑的性狀、重量差異[2]。另取10片，溶于05mL純化水中，玻璃棒沾取少量溶液，潤濕精密pH試紙，與標準比色卡對比，測其pH。按所建立間苯三酚顯色法測定每片平均含藥量。結果制得的眼用膜劑無色透明、柔韌性良好、平整無泡、厚度適宜。單片片重范圍為316～428mg，超出重量差異限度的有一片，無超出限度一倍的膜片，符合藥典規定;pH70。含藥量為0474mg/片

2.3.2 釋放度

按《中國藥典》（2015版）釋放度測定方法第三法小杯法，于第5min，15min，30min，2h，4h分別取樣5mL，同時補充同等體積的釋放介質，立即用微孔濾膜濾過，自取樣至濾過應在30秒內完成[3]。吸取02mL澄清濾液按含量測定方法于5445nm處測定硫酸軟骨素吸光度，計算濃度及累積釋放度，繪制累積釋放曲線。結果顯示15min釋放不足30%，至2h時接近完全釋放。由此預測該眼用膜劑較滴眼劑能有效延長藥物于眼部的作用時間。

2.3.3 刺激性

選用健康、無眼疾的家兔，采用左右側自身對比的方法進行硫酸軟骨素眼用膜劑的單次給藥刺激性試驗，左眼給藥，右眼為空白對照。于給藥后1h，2h，4h，6h，24h，48h，72h后至7天觀察角膜、結膜、虹膜的受損狀況即眼局部的情況。按照衛生部《新藥（西藥）臨床前研究指導原則匯編》眼部刺激性試驗反應評分表進行評分（該方法為Draize試驗改良的試驗方法）。在此評分系統中，對角膜受損的強度以及面積進行評分，為0～4分。對虹膜進行相關規定評分，為0～2分。對結膜發炎、水腫、分泌物打分，分別是0～3分，0～4分，和0～3分。刺激性嚴重程度以刺激性最大的家兔為準。按照評分標準得出的評分結果為2分，刺激性較低。

2.3.4 高溫、高濕試驗

取眼用膜劑150片置于表面皿上，開口，40℃溫度下放置10天，于第五天和第十天取樣，每次取樣量為50片，考察其外觀，含藥量，pH，與第0天進行比較。取眼用膜劑150片于表面皿上，在25℃相對濕度75%條件下放置10天，于第五天和第十天取樣，每次取樣量為50片，按高溫試驗同法進行考察。結果顯示高溫條件下10天后樣品色澤變為黃色，pH無明顯變化，含藥量增加;高濕條件下10天后樣品色澤無明顯變化，pH無明顯變化，含藥量增加。分析硫酸軟骨素可能在高溫、高濕條件下降解為在其最大吸收波長處有吸收的有關物質。

3 討論

硫酸軟骨素眼用膜劑在高溫高濕均條件下均不穩定，可能分解為未知的有關物質，有關物質的具體成分還有待考察。故該眼用膜劑應該在陰涼干燥處保存，以免發生降解、變質影響治療效果。由于該膜劑為眼用制劑，所以對它的刺激性評價尤為關鍵，在厚度、柔韌性等方面也有著嚴格要求，避免對眼部造成刺激。膜劑的性狀評價無準確標準，會因實驗人員的不同而產生較大差異，評價結果有著很強的主觀因素，會隨著評分人員的不同而產生變化。由于制備者的不同，或者批次的不同對其含量，厚度等方面都會產生影響，因此其質量不可控因素較多。

參考文獻：

[1] 張華珺，陳敏，李慧，等. 硫酸軟骨素間苯三酚光度分析法的改進研究[J]. 食品研究與開發，2006， 27（7）： 163-168

[2] 連曉佳，多種換孢菌素A眼用制劑穩定性， 結膜刺激性IL-6水平影響的研究[D]. 天津： 天津醫科大學， 2014： 6-7

[3] 李沙，李曉飛，劉娟，等.紫草膜劑的制備及左旋紫草素的含量測定[J]， 中國醫院藥學雜志， 2011， 31（12）：962-963