基于生物信息學途徑挖掘防治急性高原病的潛在藥物

施冰，崔慶華，馮振龍，李俊峽

(1.中國人民解放軍總醫院第七醫學中心干一科，北京100700;2.北京大學醫學部生物信息學系；3.安徽醫科大學研究生院)

急進高原后急性高山病(AMS)的發病率居高不下，其中高原心臟疾病是很重要的一部分[1]。文獻報道，高原環境運動者30%的死亡與高原心臟病猝死相關[2]。高原心臟病的發生發展比較復雜[3],尤其對急進高原后心臟的影響還不甚清楚[4]。前期實驗中，我們應用低氧實驗艙模擬海拔7000 m高原環境，應用超聲心動圖評估了SD大鼠在急進高原后不同時間點(3 d、7 d、14 d、28 d)心臟結構和功能變化，HE染色病理切片評估了心肌組織病理變化。發現急性高原低氧可造成大鼠心肌組織水腫，心臟收縮和舒張功能嚴重受損。急進高原第7天時大鼠心臟收縮功能受損最嚴重[5]。目前國內外對于AMS發生機制尚不十分明確，還沒有非常有效的干預策略。雖然很多研究已證實炎性因子、氧化應激等在急性高原病發生發展過程中起著重要作用，但均不足以從基因水平全面闡述急性高原病發生機制，也不足以篩選新的防治急性高原病的藥物。本研究擬通過低壓氧艙模擬高原低氧環境，建立急性高原病大鼠動物模型。通過對高原低氧暴露7 d大鼠心肌組織進行全轉錄組測序，篩選與急性高原病相關的差異表達基因。應用Connectivity Map數據庫對差異表達基因進行分析比對，通過生物信息學方法篩選潛在的防治急性高原病的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組 選取6周齡SPF級SD大鼠，體質量(200±20)g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號：SCXK(京)2016-0006。所有動物實驗均通過倫理委員會審核。采用隨機數字表法將SD大鼠分為高原低壓低氧實驗組(HH組)、常壓常氧對照組(con組)、藥物干預組(Sb203580組)。每組20只動物。

1.2 實驗儀器及實驗條件 應用實驗艙(貴州風雷航空軍械有限責任公司)模擬高原低氧條件。實驗艙參數設定：模擬海拔高度7000 m，升降速度10 m/s，艙內壓力39.1 kPa，艙內氧氣壓力9.022 kPa。實驗組和藥物干預組大鼠均置于實驗艙內。實驗艙運行時間23 h/d，晝夜比12 h∶12 h。每日上午開倉1 h更換墊料、飼料、飲用水。藥物干預組大鼠于每天開倉時腹腔注射SB203580溶液 (10 mg/kg)，每日注射1次，每只大鼠連續注射7 d。對照組大鼠置于實驗艙外，處理等同于實驗組大鼠。

1.3 方法

1.3.1 大鼠心肌組織總RNA提取 各組大鼠飼養7 d后處死，開胸取出心臟。應用Trizol試劑提取心肌組織總RNA。取100 mg心肌組織樣品，加入1 mL RNAstore樣本保存液。按照Trizol試劑說明書，一步法提取心肌組織總RNA。采用RNeasy Mini Kit純化總RNA，應用NanoDrop2000分光光度計分別測量RNA在波長為260 nm、280 nm的吸收值，間接計算出提取的RNA濃度。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。

1.3.2 大鼠心肌組織mRNA高通量測序 質檢合格的RNA進行文庫構建。使用HiSeq2500進行全轉錄組高通量測序(實驗組和對照組各6只動物)，獲得mRNA表達譜。使用FastQC對原始序列進行檢測，保留高質量的整潔序列(clean reads)。使用Cufflinks 2.0 對所有轉錄組結果進行匯總整合，并使用Ensemble轉錄本數據庫對獲得的結果進行注釋。使用Cufflinks軟件篩選差異基因。差異基因的篩選標準為同時滿足以下條件：①在兩個樣本中測序讀數之和》10的基因；②滿足│log2(FC)│>1(上調2倍或下調2倍)；③同時滿足P<0.05和FDR(false discovery rate)<0.05。高通量測序檢測由北京博奧公司完成。

1.3.3 差異基因GO分類和Pathway分析 應用SAM軟件篩選出實驗組和對照組比較，相對表達超過2倍的差異基因。應用可視化和整合發現的數據庫(DAVID )軟件對差異基因功能進行基因本體(GO)分類、生物學通路(Pathway)分析、功能注釋聚類分析，獲得差異基因相關功能的功能富集類。

1.3.4 connectivitymap藥物數據庫篩選與高原低氧作用機制拮抗的藥物 應用生物信息學工具ConnectivityMap數據庫，整合差異表達mRNA信息，推測高原低氧相關心肌損傷中差異表達基因與藥物小分子功能的關系。將比對系數OR<1且P<0.05的藥物定義為具有防治急性高原病的效應。

1.3.5 心肌組織含水量檢測 各組動物完成實驗處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS溶液漂洗，濾紙吸干。用電子天平稱量心臟濕質量后，置于80 ℃恒溫干燥箱烘干48 h 至恒質量，稱重心臟干質量。計算組織含水量=(濕重-干重) /濕重×100%。

1.3.6 心肌組織病理學檢測 各組動物完成實驗處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS溶液漂洗，濾紙吸干。組織用40 mL/L多聚甲醛溶液固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，連續切5片，片厚約4 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌組織病理學變化。

1.3.7 心肌組織AQP1 mRNA檢測 應用real time PCR技術檢測心肌組織AQP1 mRNA表達。通過Reverse Transcription Kit試劑盒將心肌組織RNA逆轉錄為cDNA,使用熒光定量PCR試劑盒進行AQP1 mRNA相對表達水平測定。檢測總體系為25 μL(其中上下游引物各0.5 μL、Premix 12.5 μL,cDNA模板2 μL、ddH2O 9.5 μL)。PCR程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測:95 ℃ 30 s,95℃5 s,60 ℃ 30 s，共40個循環。各組實驗獨立重復3次。以β-actin作為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量,引物由上海生工合成。AQP1上游引物為5’-GCCAGCGAGTTCAAGAAG-3’，下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。β-actin 上游引物為5'-TTCGCGGGCGACGATGC-3'，下游引物為5'-CGAAGTCCAGGGCGAC-3'。

2 結果

2.1 心肌組織差異表達基因篩選 將相對表達量比值在2倍以上，且差異有統計學意義(P<0.05)的mRNA作為差異表達mRNA。與對照組比較，高原低氧實驗組大鼠心肌組織中1 084個mRNA表達發生顯著變化。其中457個mRNA表達上調，627個mRNA表達下調(圖1)。圖1中，橫軸和縱軸分別表示對照組和實驗組的表達量值。紅色的點代表上調基因，綠色的點代表下調基因，黑色的點代表無顯著差異的基因。

圖1 大鼠心肌組織差異表達mRNA的散點圖

2.2 潛在防治急性高原病的藥物篩選 應用高通量測序獲得的上調基因和下調基因,建立QuerySignature格式文件。然后進入cMap網站(http://www.broadinstitute.org/cniap/),分別導入上調基因和下調基因的文件,按使用說明操作進行藥物表達譜分析。通過與cMap數據庫中己有參考基因表達譜數據進行比對,獲得每一次比對分值在1和-1之間的富集分值 (enrichment)。富集分值代表輸入的表達譜數據與比對的相應表達譜數據的相似程度。正分值表示與cMap相應表達譜數據有著較高的相似性,負分值表示輸入的表達譜與數據庫中相應表達譜表達模式相反。根據比對結果，認為小分子化合物SB203580(OR=0.047,P=0.04)具有潛在的預防急性高原病效應。

2.3 小分子化合物SB203580防治急性高原心肌損傷的效果

2.3.1 大鼠心肌組織含水量 與對照組比較，低氧組和SB203580組大鼠心肌組織含水量均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠心肌組織含水量降低(P<0.05)。提示SB203580可減輕高原低氧導致的心肌水腫。

2.3.2 大鼠心肌組織病理 心肌組織病理切片(光學顯微鏡,×200倍)提示對照組心肌細胞界限清楚，可見肌原纖維和橫紋，核清晰。低氧組可見心肌灶狀變性，心肌水腫、肌束稀疏。SB203580組偶可見心肌灶狀變性。根據心肌組織病理變化，提示SB203580可減輕高原低氧導致的心肌損傷。見圖2。

2.3.3 大鼠心肌組織AQP1mRNA表達 與對照組比較，低氧組大鼠心肌組織AQP1mRNA表達量顯著升高(P<0.01)，SB203580組大鼠心肌組織AQP1mRNA表達量未見顯著變化(P>0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠心肌組織AQP1mRNA表達量顯著降低(P<0.01)。提示SB203580可下調高原低氧大鼠心肌組織AQP1mRNA表達。見圖3。

3 討論

生物信息學綜合運用數學、計算機科學和生物學等多學科知識和工具,闡明和揭示大量數據所包含的生物學意義。隨著高通量測序和生物信息學的出現,藥物發現模式發生了重大變革。由既往偶然發現、工業合成有效成分的傳統時代進入一個以基因為基礎的藥物研發新階段。近年來,基因表達譜在藥物研究方面的應用越來越廣泛,研究人員構建了與活性化合物或藥物相關的基因表達譜數據庫,繪制了“基因-疾病-藥物”之間的關系圖。這些“關系圖”為藥物發現及研究提供了新思路,形成一種獨特的藥物發現新模式,即基于化合物或藥物基因表達譜的藥物發現模式。通過該方法可篩選到一些疾病治療候選化合物,加快了藥物發現過程,特別是對于那些臨床罕見疾病的治療藥物發掘有著更為重要的意義。

注：與常壓常氧對照組比較，aP<0.01；與高原低壓低氧實驗組比較，bP<0.01

圖3大鼠心肌組織AQP1mRNA檢測

Connectivity map (cMap)數據庫是美國麻省理工學院、哈佛大學及其附屬醫院聯合開發的數據庫。該數據庫應用基因表達譜信號揭示藥物-基因-疾病之間的相互聯系。通過對比不同藥物之間在基因組表達譜上的相關程度，即可判斷藥物在調控下游基因的方式上的相似程度，也就間接反映了不同藥物是否影響了相近的或部分重疊的下游基因。為了定量衡量一對藥物表達譜之間正向或負向的相關程度，CMap根據特定的計算方法能夠給出一個介于-1和+1之間的“聯系分值”，用以定量衡量各藥物表達譜之間的相似程度。當前cMap數據庫包含超過7 000個表達譜數據,涉及多達1 300種化合物,可應用于發現具有相似作用的藥物,提示藥物的作用機制,以及從FDA目前己有藥物中發現老藥的新用途。

水通道蛋白(AQP) 是一類廣泛分布于機體不同組織器官中的特異性跨膜轉運水的膜蛋白，共有13個亞型。可以促進水分子的快速跨膜轉運,維持細胞內外滲透壓力的平衡[6]。在心臟表達的水通道蛋白主要是AQP1亞型。文獻報道，在人類和大鼠心肌組織中，AQP1主要分布于無孔型血管內皮細胞和心肌細胞，協調水分子的跨膜轉運。生理狀態下，AQP1蛋白對于水分子的跨膜轉運影響并不明顯。病理狀態下，AQP1在缺氧條件下被誘導表達[7]。山羊體外循環手術后心肌組織中AQP1高表達,且與心肌水腫程度密切相關[8]。應用AQP1慢病毒載體轉染羊心肌組織后,心肌組織AQP1 mRNA和蛋白的表達水平均呈升高趨勢,心肌組織AQP1表達水平與心肌水腫程度呈正相關。敲除AQP1基因后,心肌水腫程度明顯降低[9]。心肌細胞水腫壞死是導致心肌缺血和各種繼發性損傷的重要環節之一。調節AQP1的表達是防止心肌水腫的一個重要途徑。臨床研究表明AQP1主要受上游ERK/MAPK、PI3K/AKT/m TOR等通路的調節,進而促進基質金屬蛋白酶、VEGF等基因表達,參與腫瘤細胞的增殖凋亡、侵襲轉移及血管生成[10]。通過cMap數據庫分析比對，我們推測小分子化合物SB203580是潛在的具有防治急性高原低氧心肌損傷的候選藥物。本研究發現,與對照組比較,低氧組大鼠心肌組織出現水腫、壞死，心肌組織中AQP1 mRNA表達顯著增高。SB203580組大鼠盡管心肌含水量輕度增高，但心肌組織病理未見顯著變化，心肌組織AQP1mRNA表達無顯著變化。SB203580是一種常用p38MAPK抑制劑，可以通透細胞，抑制p38MAPK激活，進而有效抑制一些炎性因子(如IL-1β、TNF-α)介導的部分信號傳導。本研究結果提示，SB203580可通過調控心肌組織AQP1表達,防治高原低氧導致的心肌水腫和心肌損傷。

本研究基于高通量測序和生物信息學技術，從全轉錄組水平初步揭示了高原低氧大鼠心肌損傷的作用機制。結合已知的基因功能和信號通路，以及cMap數據庫分析比對結果，初步預測了潛在的具有干預急性高原心肌損傷的藥物并進行了實驗驗證。通過本研究，將深化有關急性高原病發病機制的認識,為探索新的防治策略提供理論依據和實驗基礎。