養豬微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位特性

劉 波,陳倩倩,阮傳清,王階平,張海峰,劉國紅,陳 崢,潘志針,劉 欣

福建省農業科學院農業生物資源研究所,福州 350003

微生物發酵床(microbial fermentation bed,MFB)利用植物廢棄物如谷殼、秸稈、鋸糠、椰糠等材料制作發酵床墊層,接種微生物,豬養殖在墊層上,排出的糞便由微生物分解消納,原位發酵成有機肥[1]。大量的研究認為,微生物發酵床養殖是實現糞污無害化與環境友好型的一種自然健康養殖技術,能明顯改善豬舍內的環境衛生,消除臭味,增強免疫力,降低呼吸道和消化道等疾病的發病率,減少抗生素等藥物的使用,提高豬肉品質[2-10]。德國學者Kaufmann等研究了育肥豬微生物發酵床(the biological-bed system for fattening pigs)中豬糞營養平衡[11],法國學者Bonneau 等指出發酵床模式提供了養豬最優的環境和經濟模式[12],國內學者陳倩倩等研究了微生物發酵床對豬大腸桿菌種群抑制作用[13],鄭雪芳等報道了微生物發酵床對豬舍大腸桿菌病原的生物防治作用[14],發酵床中的芽胞桿菌對豬病防控、臭味分解、有機質降解發揮著重要的作用[15-21]。

微生物發酵床的空間微環境下,生物因子和非生物因子(營養成分、溫度、濕度、pH、通氣量等)決定了墊料微生物生長,形成了獨特的生態位。Grinnell指出從微生境(microhabitat)、非生物因子(abiotic factor)、資源(resource)和被捕食者(predator)等環境限制性因子,把空間生態位定義為“恰好被生物所占據的最后分布單位”[22]。微生物空間生態位的研究較少,賀紀正等定義了適應環境的微生物功能群所占據空間為微生物生態位[23]。王子迎等提出在一定的植物病害系統中,某種病原物在其病害循環的每個時段上的全部生態學過程中所具有的功能地位,稱為該病原物在該植物病害系統中的生態位[24]。Fazion等研究了蘇云金芽胞桿菌在昆蟲幼蟲內的孢子萌發機制,指出帶有pHT8_1質粒的菌體占據了幼蟲體內生態位,從而導致病害的擴增[25]；Zhang等研究嬰兒食品蠟狀芽胞桿菌污染菌時,發現帶有腸毒素的菌株占有了中國嬰兒食品污染菌的生態位[26]；Blackburn 等建立了吉爾吉斯斯坦炭疽芽胞桿菌生態位模型,預測炭疽病發生的風險[27]；Morton等開發了平衡樹分析軟件揭示微生物生態位變化[28]；Piché-Choquette等研究了氫氣氧化細菌改變土壤微生物生態位[29]；Hong等研究了環境差異引起的土壤奇古菌(Thaumarchaeota)生態位的分化[30]。Chikerema 等建立了津巴布韋炭疽芽胞桿菌生態位空間模型[31]。

芽胞桿菌作為優勢種類占據著微生物發酵床墊料空間生態位[13],劉國紅等利用培養分離的方法研究了養豬微生物發酵床芽胞桿菌空間分布,從32份樣品中共獲得芽胞桿菌452株,分別隸屬于芽胞桿菌綱的2個科、8個屬、48個種,總含量高達4.41×108cfu/g,微生物發酵床的芽胞桿菌種類豐富、數量高[32]。關于養豬發酵床優勢微生物群落—芽胞桿菌空間生態位特性的研究未見報道。

本研究通過采樣程序,對微生物發酵床不同空間位置的墊料進行采樣,分析墊料營養成分,利用宏基因方法組測定墊料微生物組,進行芽胞桿菌活菌計數,分析墊料芽胞桿菌空間生態位數量分布、亞群落分化、生態位寬度與重疊等,以期揭示養豬發酵床芽胞桿菌空間生態位特性,為闡明發酵床豬糞降解、臭味消除、豬病防控、資源化利用提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 微生物發酵床空間生態位墊料采樣方法

采樣地點：福建省農業科學院福清現代設施農業樣本工程示范基地。采樣對象：微生物發酵床大欄養豬舍,該大欄發酵床豬舍建筑面積為2100 m2(長60 m,寬35 m),養殖面積為1600 m2,發酵床深度80 cm,發酵床墊料由33%椰糠、33%鋸糠和34%谷殼組成。

發酵床飼養1600頭育肥豬,飼養密度為每平方米1頭,墊料管理表層30 cm每2天旋耕1次,底層不作翻耕,墊料下沉補充新墊料到原來高度,豬舍連續使用2年。將大欄發酵床長度方向劃分8欄(記為1、2、3、4、5、6、7和8),寬度方向劃分4欄(記為1、2、3、4),共32個小欄,采樣格局平面圖見圖1。根據隨機采樣法選擇采樣點,每個采樣點用五點取樣方法,采集上層0—20 cm和下層40—60 cm深度墊料,采集的樣品均勻混合后取1000 g裝入無菌聚氯乙烯塑料瓶,帶回實驗室放入4 ℃冰箱內,進行芽胞桿菌的培養分離和宏基因組分析。墊料成分測定(水分、pH、有機質、全氮、腐殖酸、粗纖維)由資質單位福建省農科院土肥所完成。

圖1 微生物發酵床空間生態位墊料采樣格局Fig.1 Sampling pattern for spatial ecological niche analysis in microbial fermentation bed for pig raising橫向1—8：豬舍橫向1—8欄；縱向1—4：豬舍縱向1—4欄

1.2 微生物發酵床空間生態位細菌宏基因組測序

按土壤DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil的操作指南,稱取500 mg墊料樣本進行總DNA的提取。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA濃度,稀釋至終濃度為1 ng/μL開展后續試驗。采用原核生物16S rDNA基因V3—V4區通用引物U341F和U785R對各墊料樣本總DNA進行PCR擴增,PCR反應重復3次。取相同體積混合后進行目的片段回收,所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)。采用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)對回收產物進行定量檢測。構建插入片段為350 bp的paired-end(PE)文庫(TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒,Illumina 公司),經Qubit定量和文庫檢測,HiSeq上機測序,測序由上海美吉完成。

1.3 微生物發酵床空間生態位芽胞桿菌活菌計數

通過梯度稀釋涂布法,分離微生物發酵床樣品中的芽胞桿菌,根據菌落形態特征等進行芽胞桿菌種類歸類、分子鑒定、統計計數,每個樣本重復3次,按墊料采樣坐標的上層和下層分別統計活菌數,進行檢驗活菌數的垂直分布差異；分離純化菌株,采用-80℃甘油冷凍法進行保存,采用Tris-飽和酚法提取芽胞桿菌基因組DNA,采用通用細菌16S rRNA引物進行擴增、測序、鑒定,方法參見Liu等所描述[33]。

1.4 微生物發酵床空間生態位芽胞桿菌數量(reads)分布

從宏基因組分析結果中提取芽胞桿菌屬及其近緣屬數量(reads)構建矩陣,分析比較墊料上層與下層數量差異、芽胞桿菌優勢屬的分布。

1.5 微生物發酵床空間生態位芽胞桿菌亞群落分化

利用宏基因組分析結果,提取芽胞桿菌屬及其近緣屬數量(reads),按上層和下層分布分別構建矩陣,以屬種類為樣本,采樣點為指標,馬氏距離為尺度,可變類平均法進行系統聚類,分析上層和下層芽胞桿菌亞群落分化特征。

1.6 微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位寬度與重疊

以芽胞桿菌的屬種類為樣本,以空間樣本為指標,構建數據矩,用Levins生態位寬度公式和Pianka生態位重疊公式分別計算生態位寬度和生態位重疊值[34]。計算公式如下：

(2)Pianka生態位重疊公式(Oik)：

式中,Oik為芽胞桿菌屬種類i和種類k的生態位重疊值,nij和nkj為芽胞桿菌屬種類i和k在資源單位j中所占的個體比例,r為芽胞桿菌屬種類個體總數。分析軟件采用DPS v16.05數據處理系統。

2 結果與分析

2.1 微生物發酵床空間生態位墊料營養特性與芽胞桿菌活菌數分析

墊料營養特征指標測定實驗結果見表1。微生物發酵床采樣點墊料營養特性差異顯著,墊料含水量差異范圍為37.7%—62.6%,pH差異范圍為6.2—9.2,有機質差異范圍為37.4%—48.5%,全氮范圍為2.0%—3.2%,腐殖酸差異范圍為9.3%—16.5%,粗纖維差異范圍為10.0%—17.8%。上層墊料與下層墊料的成分特性存在顯著差異,上層墊料的水分和pH值低于下層,有機質和粗纖維含量高于下層,全氮和腐殖酸低于下層。

表1 微生物發酵床采樣點墊料營養特性分析Table 1 Analysis of nutritional characteristics of the bedding litters sampled from the microbial fermentation bed

續表

實驗測定微生物發酵床墊料芽胞桿菌活菌數(表2),并根據芽胞桿菌活菌數進行統計分析(表3)。微生物發酵床墊料空間采樣點芽胞桿菌活菌數量存在顯著差異,最小含量為4.3(×106cfu/mL),最大含量為26.7(×106cfu/mL)；墊料上層(0—20 cm)采樣單元芽胞桿菌含量平均值為15.34(×106cfu/mL),下層(40—60 cm)采樣單元平均值為11.81(×106cfu/mL),兩處理方差齊性,均值差異檢驗t=1.1634,df=12,P=0.2673。檢測結果表明,上層墊料與下層墊料芽胞桿菌數量差異不顯著(P>0.05)。

2.2 微生物發酵床空間生態位細菌宏基因組測序

測序結果見表4。墊料樣本短序列(reads)范圍為83279—135829條,細菌種類(OTUs)范圍為929—1714個,測序覆蓋度(Coverage)均在0.99以上；Ace指數、Chao指數、香農指數(Shannon)、辛普森指數(Simpson)。樣本的稀釋曲線(圖2)和香農指數稀釋曲線(圖3)接近平臺,表明測序深度已經基本覆蓋樣本中的所有細菌物種,覆蓋率高(>0.99)。

表3 微生物發酵床墊料空間樣本芽胞桿菌活菌計數均數t檢驗*Table 3 T-test on colony forming unit of the Bacillus-like species taken from the MFB

*均值差異檢驗t=1.1634,df=12,P=0.2673

表4 微生物發酵床墊料空間生態位樣本細菌宏基因組測定Table 4 Metagenome sequencing of the space ecological niche samples from the MFB

2.3 基于宏基因測序微生物發酵床空間生態位芽胞桿菌含量(reads)分布

2.3.1屬水平的芽胞桿菌種類鑒定

利用宏基因測序,鑒定出芽胞桿菌目21個屬(表5)和非芽胞桿菌目的3個屬,分屬于6芽胞桿菌個科,即芽胞桿菌科、脂環酸芽胞桿菌科、類芽胞桿菌科、動球菌科、芽胞乳桿菌科、待建立的科；相對含量最高的前3個屬為Bacillus(芽胞桿菌屬)(reads=8020)、Lactobacillus(乳桿菌屬)(reads=4565)、Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬)(reads=1418)；其中Halothiobacillus*(鹽硫桿狀菌屬)屬于γ-變形菌綱細菌,Roseibacillus*(玫瑰桿菌屬)屬于疣微菌綱細菌,Lactobacillus(乳桿菌屬)屬于乳桿菌目細菌。Ammoniibacillus#、Desulfuribacillus#、Roseibacillus*#、Tuberibacillus# 4個屬在國內未見研究報道,為國內新記錄屬。

圖2 發酵床墊料樣本細菌read稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of bacterial reads in the litter samples from the MFB

圖3 發酵床墊料樣本細菌香農指數稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of shannon index of bacteria in the litter samples from the MFB

表5 基于宏基因測序微生物發酵床墊料屬水平芽胞桿菌種類鑒定Table 5 Identification of the Bacillus-like genera in the litter samples from the MFB based on metagenome sequencing

*為非芽胞桿菌綱種類,#為中國新記錄屬

2.3.2芽胞桿菌數量(reads)垂直分布

根據宏基因組測序的芽胞桿菌(reads)測定(表6),進行微生物發酵床上層和下層芽胞桿菌屬水平含量(reads)均數t檢驗,分析結果見表7。上層芽胞桿菌數量平均值為1212.13,占細菌總數的1.25%；下層芽胞桿菌數量平均值為1339.43,占細菌總數的1.06%；兩處理方差齊性,均值差異檢驗t=0.0798,df=12,P=0.9377,統計學上差異不著(P>0.05)。檢測結果表明,上層墊料與下層墊料芽胞桿菌數量差異不顯著。

表6 基于宏基因組測序的微生物發酵床芽胞桿菌屬水平含量(序列數)Table 6 Contents(reads)of the Bacillus-like genera in the litter samples from the MFB based on metagenome sequencing

表7 基于宏基因組測序的微生物發酵床上層和下層芽胞桿菌屬水平含量(reads)均數t檢驗*Table 7 T-test on contents (reads) of the Bacillus-like species in upper layer and under layer litters taken from the MFB

*均值差異檢驗t=0.0798,df=12,P=0.9377

圖4 微生物發酵床墊料樣芽胞桿菌數量分布Fig.4 Read distribution of the Bacillus-like genera in the MFBRoseibacillus(玫瑰桿菌屬)、Solibacillus(土芽孢桿菌屬)、Desulfuribacillus(脫硫芽孢桿菌屬)、Sinibacillus、Ammoniibacillus(氨芽孢桿菌屬)、Sulfobacillus(硫芽孢桿菌屬)、Caldalkalibacillus(熱堿芽孢桿菌屬)、Rummeliibacillus(魯梅爾芽孢桿菌屬)、Amphibacillus(兼性芽孢桿菌屬)、Aneurinibacillus(解硫胺素桿菌屬)、Halolactibacillus(鹽乳桿菌屬)、Thermobacillus(熱芽孢桿菌屬)、Vulcanibacillus(武爾坎努斯桿菌屬)、Ornithinibacillus(鳥氨酸芽孢桿菌屬)、Ureibacillus(脲芽孢桿菌屬)、Oceanobacillus(海洋芽孢桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Halothiobacillus(鹽硫桿狀菌屬)、Paucisalibacillus(微鹽桿菌屬)、Gracilibacillus(纖細芽胞桿菌屬)、Geobacillus(地芽孢桿菌屬)、Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)

圖5 微生物發酵床上層和下層芽胞桿菌數量分布Fig.5 Read distribution of the Bacillus-like genera in the upper layer and under layer litters in the MFBSulfobacillus(硫芽孢桿菌屬)、Solibacillus(土芽孢桿菌屬)、Roseibacillus(玫瑰桿菌屬)、Desulfuribacillus(脫硫芽孢桿菌屬)、Aneurinibacillus(解硫胺素桿菌屬)、Sinibacillus、Amphibacillus(兼性芽孢桿菌屬)、Caldalkalibacillus(熱堿芽孢桿菌屬)、Ammonii-bacillus(氨芽孢桿菌屬)、Rummeliibacillus(魯梅爾芽孢桿菌屬)、Thermobacillus(熱芽孢桿菌屬)、Ureibacillus(脲芽孢桿菌屬)、Halolactibacillus(鹽乳桿菌屬)、Vulcanibacillus(武爾坎努斯桿菌屬)、Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬)、Ornithinibacillus(鳥氨酸芽孢桿菌屬)、Halothiobacillus(鹽硫桿狀菌屬)、Paucisalibacillus(微鹽桿菌屬)、Oceanobacillus(海洋芽孢桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Gracilibacillus(纖細芽胞桿菌屬)、Geobacillus(地芽孢桿菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)

2.3.3芽胞桿菌優勢屬分布

不同芽胞桿菌屬及其近緣屬數量(reads)發酵床分布結果顯示(圖4)：微生物發酵床14個墊料樣本檢測到24個芽胞桿菌屬,總量(reads)達19073,不同屬數量分布差異顯著,前5個分布最多的優勢屬為芽胞桿菌屬(Bacillus)(8020)、乳桿菌屬(Lactobacillus)(4565)、腫塊芽胞桿菌屬(Tuberibacillus)(1418)、地芽胞桿菌屬(Geobacillus)(796)和纖細芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)(661)。

芽胞桿菌在墊料上層和下層垂直分布顯示(圖5)：上層墊料芽胞桿菌各屬總量(reads)為9697,含量最低的為土芽胞桿菌屬(Solibacillus)僅為7(reads),最高的為芽胞桿菌屬(Bacillus)達3730(reads)；下層墊料芽胞桿菌各屬總量(reads)為9376,總量與上層差異不顯著,含量最低的玫瑰桿菌屬(Roseibacillus)為0,最高的為芽胞桿菌屬(Bacillus)達4290。不同芽胞桿菌優勢屬在墊料上層和下層數量垂直分布差異顯著(圖6),如芽胞桿菌屬(Bacillus)上層分布(3730)低于下層分布(4290),腫塊芽胞桿菌屬(Tuberibacillus)上層(98)低于下層(1320)；乳桿菌屬(Lactobacillus)上層(3363)分布高于下層(1202),地芽胞桿菌屬(Geobacillus)上層(622)高于下層(174),纖細芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)上層(490)高于下層(171)等等。

2.4 微生物發酵床空間生態位芽胞桿菌亞群落分化

分別構建上層和下層墊料不同樣本芽胞桿菌數量(reads)矩陣,以屬為樣本,樣方為指標,馬氏距離為尺度,可變類平均法進行系統聚類。可以看出,墊料上下層芽胞桿菌亞群落分化存在顯著差異。

墊料上層(表8、圖6),芽胞桿菌亞群落分化為4個組,第1組為微含量組,數量(reads)總和為18.67,包含了9個芽胞桿菌屬,即Ammoniibacillus(氨芽孢桿菌屬)、Amphibacillus(兼性芽孢桿菌屬)、Aneurinibacillus(解硫胺素桿菌屬)、Caldalkalibacillus(熱堿芽孢桿菌屬)、Desulfuribacillus(脫硫芽孢桿菌屬)、Roseibacillus(玫瑰桿菌屬)、Sinibacillus、Solibacillus(土芽孢桿菌屬)、Ureibacillus(脲芽孢桿菌屬)；第2組為高含量組,數量(reads)總和為1494.99,包含了3個芽胞桿菌屬,即Bacillus(芽孢桿菌屬)、Geobacillus(地芽孢桿菌屬)、Ornithinibacillus(鳥氨酸芽孢桿菌屬)；第3組為中含量組,數量(reads)總和為553.48,包含了8個芽胞桿菌屬,即Gracilibacillus(纖細芽胞桿菌屬)、Halothiobacillus(鹽硫桿狀菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Oceanobacillus(海洋芽孢桿菌屬)、Paucisalibacillus(微鹽桿菌屬)、Rummeliibacillus(魯梅爾芽孢桿菌屬)、Sulfobacillus(硫芽孢桿菌屬)、Thermobacillus(熱芽孢桿菌屬)；第4組為低含量組,數量(reads)總和為154,包含了4個芽胞桿菌屬,即Halolactibacillus(鹽乳桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬)、Vulcanibacillus(武爾坎努斯桿菌屬)。

圖6 上層墊料芽胞桿菌亞群落分化Fig.6 Cluster on subcommunity polarization for the Bacillus-like genera in the upper layer litters in the MFBTuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Vulcanibacillus(武爾坎努斯桿菌屬)、Halolactibacillus(鹽乳桿菌屬)、Oceanobacillus(海洋芽孢桿菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Sulfobacillus(硫芽孢桿菌屬)、Halothiobacillus(鹽硫桿狀菌屬)、Thermobacillus(熱芽孢桿菌屬)、Paucisalibacillus(微鹽桿菌屬)、Rummeliibacillus(魯梅爾芽孢桿菌屬)、Gracilibacillus(纖細芽胞桿菌屬)、Ornithinibacillus(鳥氨酸芽孢桿菌屬)、Geobacillus(地芽孢桿菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)、Ureibacillus(脲芽孢桿菌屬)、Solibacillus(土芽孢桿菌屬)、Aneurinibacillus(解硫胺素桿菌屬)、Caldalkalibacillus(熱堿芽孢桿菌屬)、Desulfuribacillus(脫硫芽孢桿菌屬)、Amphibacillus(兼性芽孢桿菌屬)、Roseibacillus(玫瑰桿菌屬)、Sinibacillus、Ammoniibacillus(氨芽孢桿菌屬)

墊料下層(表9、圖7)芽胞桿菌亞群落分化為4個組,第1組為微含量組,數量(reads)總和為57.27,包含了11個芽胞桿菌屬,即Ammoniibacillus(氨芽胞桿菌屬)、Amphibacillus(兼性芽孢桿菌屬)、Aneurinibacillus(解硫胺素桿菌屬)、Caldalkalibacillus(熱堿芽孢桿菌屬)、Desulfuribacillus(脫硫芽孢桿菌屬)、Halolactibacillus(鹽乳桿菌屬)、Halothiobacillus(鹽硫桿狀菌屬)、Roseibacillus(玫瑰桿菌屬)、Rummeliibacillus(魯梅爾芽孢桿菌屬)、Sinibacillus、Solibacillus(土芽孢桿菌屬)；第2組為中含量組,數量(reads)總和為756,包含了7個芽胞桿菌屬,即Bacillus(芽孢桿菌屬)、Geobacillus(地芽孢桿菌屬)、Gracilibacillus(纖細芽孢桿菌屬)、Oceanobacillus(海洋芽孢桿菌屬)、Ornithinibacillus(鳥氨酸芽孢桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Thermobacillus(熱芽孢桿菌屬)；第3組為低含量組,數量(reads)總和為451.75,包含了4個芽胞桿菌屬,即Lactobacillus(乳桿菌屬)、Paucisalibacillus(微鹽桿菌屬)、Sulfobacillus(硫芽孢桿菌屬)、Vulcanibacillus(武爾坎努斯桿菌屬)；第4組為高含量組,數量(reads)總和為823.5,包含了2個芽胞桿菌屬,即Tuberibacillus(腫塊芽孢桿菌屬)、Ureibacillus(脲芽孢桿菌屬)。

2.5 微生物發酵床空間生態位芽胞桿菌數量(reads)與墊料營養特性的相關性

2.5.1微生物發酵床墊料營養特性主成分分析

基于微生物發酵床墊料營養特性測定數據矩陣,以歐氏距離為尺度,進行聚類分析和主成分析,結果見表10、表11、圖8。墊料營養特性的第1主成分特征值達96.15,包含了主要信息；主成分分析得分可以看出,墊料水分、有機質得分較高,為正值,全氮及其其他因子得分為負值,形成了3個分支,這與聚類分析結果相符合,形成3個主成分,即水分主成分、有機質主成分、營養主成分(圖8)。

表8 上層墊料芽胞桿菌屬亞群落分化Table 8 Subcommunity polarization for the Bacillus-like genera in the upper layer litters in the MFB

表9 下層墊料芽胞桿菌屬亞群落分化Table 9 Subcommunity polarization for the Bacillus-like genera in the under layer litters in the MFB

圖7 下層墊料芽胞桿菌亞群落分化Fig.7 Cluster on subcommunity polarization for the Bacillus-like genera in the under layer litters in the MFB Ureibacillus(脲芽孢桿菌屬)、Tuberibacillus(腫塊芽孢桿菌屬)、Paucisalibacillus(微鹽桿菌屬)、Vulcanibacillus(武爾坎努斯桿菌屬)、Sulfobacillus(硫芽孢桿菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Gracilibacillus(纖細芽孢桿菌屬)、Ornithinibacillus(鳥氨酸芽孢桿菌屬)、Oceanobacillus(海洋芽孢桿菌屬)、Thermobacillus(熱芽孢桿菌屬)、Geobacillus(地芽孢桿菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)、Solibacillus(土芽孢桿菌屬)、Sinibacillus、Roseibacillus(玫瑰桿菌屬)、Halolactibacillus(鹽乳桿菌屬)、Rummeliibacillus(魯梅爾芽孢桿菌屬)、Halothiobacillus(鹽硫桿狀菌屬)、Aneurinibacillus(解硫胺素桿菌屬)、Desulfuribacillus(脫硫芽孢桿菌屬)、Caldalkalibacillus(熱堿芽孢桿菌屬)、Ammoniibacillus(氨芽胞桿菌屬)、Amphibacillus(兼性芽孢桿菌屬)

表10 微生物發酵床墊料營養特性主成分特征值Table 10 Principal component eigenvalues for nutrition characteristics of the litters in the MFB

表11 微生物發酵床墊料營養特性主成分分析得分Table 11 Principal component analysis score for nutrition characteristics of the litters in the MFB

圖8 微生物發酵床墊料營養特性聚類分析與主成分分析Fig.8 Cluster and principal component analyses of nutrition characteristics of the litters in the MFB

2.5.2芽胞桿菌數量與墊料成分特性相關性分析

以芽胞桿菌數量(reads)和墊料營養特性為樣本,墊料空間樣本為指標,構建矩陣(表12),進行相關性分析,芽胞桿菌與營養條件的相關系數見表10。相關系數顯著檢驗的臨界值a=0.05時,r=0.5324(顯著),a=0.01時,r=0.6614(極顯著)；結果表明水分主成分提供了芽胞桿菌生存條件,不同的屬存在差異,與Geobacillus(-0.6825)、Gracilibacillus(-0.6804)、Lactobacillus(-0.6636)呈顯著負相關；基質主成分(有機質)提供了芽胞桿菌生存基質,對所有芽胞桿菌相關系數不顯著,都是需要的；營養主成分提供了芽胞桿菌營養條件,不同屬存在差異,與Vulcanibacillus(0.7063)極顯著相關,全氮與Sinibacillus(0.6021)顯著相關,腐殖酸與Ureibacillus(0.6898)極顯著相關,其余相關性不顯著。

表12 表2(營養特性)和表6(芽胞桿菌含量(reads))合并Table 12 Merging of table 2 and table 6

續表

表13 芽胞桿菌數量(序列數)與墊料營養條件的相關系數Table 13 Correlation coefficient between number(reads)of theBacillus-like genera and nutrition characteristics of the litters in the MFB

屬名Genus names水分Moisture/%有機質Organic material/%pH全氮 Total nitrogen/%腐殖酸 Humic acid/%粗纖維Crude fiber/%Ammoniibacillus氨芽孢桿菌屬-0.51190.0031-0.00700.20800.0084-0.1900Amphibacillus兼性芽孢桿菌屬-0.44330.0409-0.31710.0805-0.04570.2856Aneurinibacillus解硫胺素桿菌屬-0.0460-0.4850-0.11080.16230.2774-0.0843Bacillus芽孢桿菌屬-0.49650.2611-0.5171-0.1632-0.05840.3118Caldalkalibacillus熱堿芽孢桿菌屬-0.3635-0.2709-0.03290.13950.1094-0.1877Desulfuribacillus解硫芽孢桿菌屬0.36460.22920.4569-0.0978-0.0655-0.3102Geobacillus地芽孢桿菌屬-0.6825??0.16150.05170.10090.1228-0.0390Gracilibacillus纖細芽孢桿菌屬-0.6804??0.17050.03110.16370.1075-0.0222Halolactibacillus鹽乳桿菌屬-0.16350.2636-0.2929-0.2683-0.10590.1276Halothiobacillus鹽硫桿狀菌屬0.05610.0388-0.16430.4625-0.3250-0.0310Lactobacillus乳桿菌屬-0.6636??0.4257-0.0396-0.0688-0.03720.0091Oceanobacillus海洋芽孢桿菌屬-0.5776?0.3603-0.09040.3544-0.04850.1048Ornithinibacillus鳥氨酸芽孢桿菌屬-0.2911-0.0543-0.22790.26080.34300.0803Paenibacillus類芽孢桿菌屬-0.39840.1706-0.34800.1436-0.29830.2823Paucisalibacillus微鹽桿菌屬0.04050.19420.21500.14630.5207-0.2058Roseibacillus玫瑰桿菌屬0.3363-0.2423-0.0506-0.0955-0.3635-0.3112Rummeliibacillus魯梅爾芽孢桿菌屬-0.05110.3706-0.1736-0.3029-0.3868-0.0823Sinibacillus0.22150.03760.10730.6021?0.3211-0.0314Solibacillus土芽孢桿菌屬0.0195-0.03680.37550.3017-0.0992-0.1824Sulfobacillus硫芽孢桿菌屬-0.1057-0.6388?-0.20520.39060.5682?0.2463Thermobacillus熱芽孢桿菌屬-0.0306-0.4414-0.13350.15550.3590-0.0438Tuberibacillus腫塊芽孢桿菌屬-0.24680.2253-0.4478-0.2551-0.04690.2254Ureibacillus脲芽孢桿菌屬0.21790.08930.23240.29110.6898??-0.0464Vulcanibacillus武爾坎努斯桿菌屬0.4947-0.14130.7063??-0.1112-0.1374-0.4899

續表

*相關系數臨界值Correlation coefficient critical value,a=0.05時,r=0.5324,a=0.01時,r=0.6614

2.6 微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位寬度

2.6.1芽胞桿菌生態位寬度

分析結果見表14,空間生態位寬度Levins測度范圍為10.5159(Bacillus)—1.3178(Tuberibacillus),前5個營養生物位較寬的屬有：Bacillus(10.5159)、Ornithinibacillus(8.6094)、Paenibacillus(7.8463)、Oceanobacillus(6.9927)、Rummeliibacillus(5.7417)、Vulcanibacillus(4.9111)；可利用資源數最大的是5(Paenibacillus),最小的是1(Roseibacillus)；當截斷比例為0.10—0.18時,Paenibacillus擁有最多的常用資源,分別為S2=9.98%、S6=14.15%、S11=14.39%、S12=12.76%、S14=21.58%,Roseibacillus的常用資源僅為1個,S2=62.50%。

表14 芽胞桿菌空間生態位寬度Table 14 Space ecological niche breath of the Bacillus-like genera

續表

2.6.2生態位寬度與墊料營養相關性

結合芽胞桿菌數量與墊料營養條件相關性表12和芽胞桿菌生態寬度表13進行分析,空間生態位較寬的屬,其與墊料營養因子相關性較弱,如Bacillus(10.5159)、Ornithinibacillus(8.6094)、Paenibacillus(7.8463)、Oceanobacillus(6.9927)、Rummeliibacillus(5.7417)等,與墊料營養因子(水分、pH、有機質、全氮、腐殖酸等)之間相關性不顯著,即對營養要求不高,適應性更廣；空間生態位較窄的屬,其與墊料營養因子相關性較強,如Gracilibacillus(2.7893,與水分呈反比)、Geobacillus(1.8377,與水分呈反比)、Ureibacillus(2.3850,與腐殖酸呈正比)等,與墊料某些營養因子之間相關性顯著,即對營養要求較高,適應性窄。

2.7 微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位重疊

2.7.1芽胞桿菌生態位重疊

分析結果見表15,分析表明空間生態位重疊Pianka測度范圍為0.00—0.99。空間生態位重疊>0.90的屬有：Gracilibacillus和Ammoniibacillus,Thermobacillus和Aneurinibacillus,Gracilibacillus和Geobacillus,Lactobacillus和Geobacillus,Lactobacillus和Gracilibacillus,Tuberibacillus和Halolactibacillus,這些屬之間生態位重疊很高；空間生態位重疊=0.00的屬有：Desulfuribacillus和Aneurinibacillus,Tuberibacillus和Desulfuribacillus,Tuberibacillus和Roseibacillus*,它們之間生態位幾乎不重疊。

表15 芽胞桿菌空間生態位重疊Table 15 Correlation coefficient between space ecological niche overlap for Bacillus-like genera in the litter from the MFB

2.7.2種群數量與生態位重疊關系

結合芽胞桿菌數量(表6)和生態位重疊(表15)進行分析,芽胞桿菌含量與其生態位重疊分為3種形式,即非極端重疊型(生態位重疊介于0.20—0.80之間)、全程重疊型(0.00—1.00之間)、極端重疊型(<0.20或>0.80)；高含量的芽胞桿菌屬(Bacillus))(reads=8020)除了與Desulfuribacillus生態位重疊在0.07之外,與其他屬生態位重疊范圍在0.19—0.75之間,生態位重疊沒有超過0.75,低于0.20的也少,屬于非極端重疊型；高含量的乳桿菌屬(Lactobacillus)(reads=4565)與其他屬生態位重疊超過0.8的有Geobacillus和Gracilibacillus；低于0.20的有Aneurinibacillus(0.05)、Roseibacillus(0.12)、Sinibacillus(0.13)、Sulfobacillus(0.06)、Thermobacillus(0.08)、Ureibacillus(0.09),大部分在0.20—0.80之間,屬于全程重疊型；高含量的腫塊芽胞桿菌屬(Tuberibacillus)(reads=1418)與其他屬生態位重疊在0.320—0.80之間的只有2個屬,即Amphibacillus(0.78)、Rummeliibacillus(0.48),大部分生態位重疊<0.20或>0.80,屬于極端重疊型。

2.7.3生態位寬度與生態位重疊關系

結合表14和表15進行分析,芽胞桿菌空間生態位寬度與生態位重疊存在著相互關系,生態位較寬的屬,如芽胞桿菌屬(Bacillus)與鳥氨酸芽胞桿菌屬(Ornithinibacillus)、與類芽胞桿菌屬(Paenibacillus),它們與其他屬之間的空間生態位重疊集中在0.30—0.70之間,較少出現<0.20或>0.80極端重疊；空間生態位較窄的屬,如Roseibacillus、Geobacillus、Desulfuribacillus、Tuberibacillus與其他屬之間的空間生態位重疊經常出現極端重疊狀況,即生態位重疊主要分布在<0.20或>0.80。

3 討論

芽胞桿菌能夠產生芽胞,是一類能在多種環境尤其是極端環境下生存的微生物,具有很強的抗逆性[58]。芽胞桿菌在養殖廢棄物處理方面具有重要作用,如臭味分解、有機質降解等。本研究采用活菌分離培養及宏基因組技術,從養豬微生物發酵床墊料中分析到芽胞桿菌24個屬(其中2個屬具有芽胞桿菌種名特性,不屬于芽胞桿菌),相對含量最高的前3個屬為Bacillus(芽胞桿菌屬,芽胞桿菌科)(reads=8020)、Lactobacillus(乳桿菌屬,芽胞桿菌綱)(reads=4565)、Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬,芽胞乳桿菌科)(reads=1418),成為優勢屬。盡管未見在微生物發酵床類似研究報道,但有報道表明這3個芽胞桿菌綱的屬也是某些環境中的優勢屬,Hatayama等報道了Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬)為堆肥過程的優勢屬[59]；Mowlick 等報道了腫塊芽胞桿菌屬具有耐酸和耐高溫的特性,在溫室栽培經過三氯甲烷消毒的土壤中成為優勢屬[60]；乳桿菌屬是豬腸道微生物的優勢屬[61]。微生物發酵床空間生態位中芽胞桿菌優勢屬保持著較高的種群數量,對豬糞降解和除臭消除起著重要作用,這一結果與徐慶賢等報道的芽胞桿菌屬對于發酵豬糞和分解臭味起到重要作用一致[62]。研究發現微生物發酵床中Ammoniibacillus(氨芽胞桿菌屬,類芽胞桿菌科)、Desulfuribacillus(脫硫芽胞桿菌屬,待建立新科)、Tuberibacillus(腫塊芽胞桿菌屬,芽胞乳桿菌科),在國內未見報道,為中國新記錄屬,微生物發酵床中分布著如此多的芽胞桿菌屬及其近緣屬,未見相關研究報道。采用活菌計數和宏基因測序兩種方法研究發現,將微生物發酵床整體作為一個生態位考察,不同空間采樣的芽胞桿菌分布的數量差異較大,活菌計數空間樣本芽胞桿菌含量范圍4.3—26.7×106cfu/mL之間,相差6.2倍；宏基因測序含量(reads)范圍在424—4130之間,相差9.7倍；活菌計數無法統計不可培養的芽胞桿菌,兩種方法檢測出的芽胞桿菌差異在同一個數量級；王香君等利用實時熒光定量PCR法和活菌計數定量魚露和蝦細菌,兩種方法相差1—2個數量級[63]；屠騰等利用細胞計數手段和DGGE技術分析松花江干流部分地區的細菌種群多樣性[64]；活菌計數和宏基因測序測定芽胞桿菌數量與之異曲同工,檢測精度更高。

將微生物發酵床上層(0—20 cm)和下層(40—60 cm)不同深度的作為生態位考察,盡管微生物發酵床上下層墊料空間生態位營養特性差異顯著,上層墊料的水分、pH值、全氮、腐殖酸低于下層,而好氧條件(上層2天翻耕1次,下層不翻耕)、有機質(豬糞增加在上層)、粗纖維(補充墊料在上層)含量高于下層,兩種檢測方法的芽胞桿菌總量上下層差異不顯著；這種生態位差異要保持芽胞桿菌總數的平衡,是以發酵床上、下層生態位中芽胞桿菌種類分布變化差異為依據,上層生態位前5位高含量芽胞桿菌優勢屬(數量平均值)分別為Bacillus(532.86)、Lactobacillus(480.43)、Geobacillus(88.86)、Gracilibacillus(70.00)、Paenibacillus(40.86),而下層為Bacillus(612.86)、Tuberibacillus(188.57)、Lactobacillus(171.71)、Paucisalibacillus(60.00)、Ureibacillus(46.71),表明上下層不同芽胞桿菌優勢種類選擇不同營養特性的墊料生態位,維持著數量平衡；從而導致墊料上下層生態位中芽胞桿菌亞群落分化,構建了發酵床生態位中特異性芽胞桿菌亞群落。微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位寬度是由發酵床營養和環境條件與芽胞桿菌生物學特性相互作用的結果。那些對發酵床環境條件適應范圍較寬、對營養條件要求較低的種類,其空間生態位寬度較寬,可利用的資源數較多,反之亦然；芽胞桿菌空間生態位較寬的屬,其與墊料營養和環境因子相關性較弱,如Bacillus(生態位寬度=10.5159)、Ornithinibacillus(8.6094)、Paenibacillus(7.8463)、Oceanobacillus(6.9927)、Rummeliibacillus(5.7417)等,與墊料營養和環境因子(水分、pH、有機質、全氮、腐殖酸等)之間相關性不顯著(P>0.05),即對營養要求不高,適應性更廣；空間生態位較窄的屬,其與墊料營養和環境因子相關性較強,如Gracilibacillus(生態位寬度=2.7893,相關系數=-0.6804,與水分呈反比)、Geobacillus(1.8377,—0.6825,與水分呈反比)、Ureibacillus(2.3850,0.6898,與腐殖酸呈正比)等,這種與墊料某些營養和環境因子之間相關性顯著,表明對營養和環境要求較高,適應性窄；由芽胞桿菌生物學特性適應環境條件形成的生態位特征,決定了其生境選擇性；如芽胞桿菌屬(Bacillus)能很好地適應許多不同類型生境,生態位寬度很廣,成為生境內的優勢種。芽胞桿菌屬這種營養和環境適應性在其他的研究中有過報道,張福特等自佳西熱帶雨林土壤中分離到147株芽胞桿菌,其中芽胞桿菌屬(Bacillus)是優勢屬,形成熱帶雨林土壤生態位芽胞桿菌特征種群[65]；朱碧春等自南極土壤中分離到23株芽胞桿菌,主要為芽胞桿菌屬(Bacillus),形成南極土壤生態位芽胞桿菌特征種群[66]。另一些種類如地芽胞桿菌屬(Geobacillus)要求生存條件比較苛刻,生態位寬度較窄,只能在特定生境下生存,Sung等自堆肥系統中分離到一株Geobacillustoebii,此后多種耐熱的地芽胞桿菌屬細菌被分離鑒定,此屬細菌在45℃以上溫度下生存,最適生長溫度為60℃,對生長環境要求高,是高溫生態位的優勢屬[67]。

微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位重疊研究發現,有些屬之間的空間生態位重疊度很高(>0.90),如：Gracilibacillus和Ammoniibacillus,Thermobacillus和Aneurinibacillus,這些屬之間生態位重疊超過0.90,享有共同的資源,存在競爭關系；有些屬之間的空間生態位重疊度很低(0.00),如Desulfuribacillus和Aneurinibacillus,Tuberibacillus和Desulfuribacillus,它們之間生態位幾乎不重疊,對資源的要求不同,不存在競爭關系。芽胞桿菌生態位重疊與其生態位寬度存在著相關關系,生態位較寬的屬,如芽胞桿菌屬(Bacillus),與鳥氨酸芽胞桿菌屬(Ornithinibacillus)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)之間的空間生態位重疊集中在0.20—0.80之間,為常規重疊,較少出現<0.20或>0.80的極端重疊；空間生態位較窄的屬,如Roseibacillus、Geobacillus、Desulfuribacillus、Tuberibacillus,與其他屬之間的空間生態位重疊經常出現極端狀況,即生態位重疊主要分布在<0.20或>0.80,要么重疊度很低(競爭關系弱),要么重疊度很高(競爭關系強),相關的研究未見報道,這一特性的研究對于了解芽胞桿菌在生態位中的資源利用具有重要意義。

微生物發酵床中芽胞桿菌種類根據生態位特性天然地形成了多菌株共存的微生物體系,共同完成豬糞消納和臭味降解過程,這與EM菌群人工培養的復合微生物菌劑系統的功能具有相似性[68]。微生物有各自特定的生活環境,微生物分解功能在其適合的生長環境中得到發揮,因此,菌群生長環境的營養條件和生存條件形成的生態位特征選擇了微生物；范瑞娟等發現受混合烴污染的土壤選擇了由芽胞桿菌屬、嗜氫菌屬及鞘脂菌屬等組成的復合微生物菌群,其能顯著降低土壤中混合烴的含量[69]。李丹紅等揭示了白蟻腸道環境適合于包含沙雷氏菌屬(Serratia)和類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)的降解纖維素的混合菌群生存,對纖維素實施協同降解[70-71]。芽胞桿菌是環境中重要的有機物降解菌,王小英等自青海可可西里土壤特定生態位中分離嗜堿芽胞桿菌,環境脅迫和馴化使之能夠產生蛋白酶、纖維素酶及木聚糖酶等多種酶系,在滿足自身生長的同時發揮著生態功能[72]。對微生物發酵床生豬糞污降解系統中的芽胞桿菌生態位的研究,有助于理解養殖糞污形成的生態位環境,選擇特定的芽胞桿菌種類,發揮特定的生態功能,為闡明微生物發酵床豬糞降解、臭味消除、豬病防控、資源化利用等提供科學數據。