喀斯特植被演替過程土壤叢枝菌根真菌(AMF)多樣性

林 艷,何躍軍,何敏紅,吳春玉,方正圓,韓 勖,徐鑫洋,王世雄

貴州大學林學院,貴陽 550025

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是一類能與絕大部分植物根系形成共生體,廣泛分布于自然界中,并對植物的生長及發育有著極其重要作用的菌根真菌[1-2]。AMF多樣性影響著不同生態系統的植物群落結構、多樣性和生產力,并在生態系統的植被演替及恢復過程中扮演著重要角色[3-4]。

中國西南喀斯特溶巖地區是世界三大溶巖區之一,且是連片裸露碳酸鹽巖面積最大的片區,由于其特殊而復雜的土壤侵蝕過程導致該地區水土流失并形成石漠化,嚴重阻礙了區域生態平衡[5-6],石漠化治理成為維護區域社會經濟與生態環境的可持續發展的一項重要內容[7]。喀斯特植被恢復受微生物群落結構的影響,有研究者認為AMF可能成為喀斯特石漠化治理中采用菌根生物技術應用的重要選擇,其前提是要篩選出適合于該區域的AMF菌種[8]。雖然已有研究學者對喀斯特地區AMF的研究開展了一些前期工作,如AMF對喀斯特生境植物光合生理的作用[9]、氮磷營養吸收[10]及對寄主植物抗旱性的影響[11-12]等方面,也有少數作者進行喀斯特生境下的AMF形態鑒定的多樣性分析[13]或遺傳多樣性分析[14-16]。充分了解喀斯特生境中的AMF多樣性及分布狀況,有助于將AMF運用于石漠化治理[17],有學者曾研究草原生態系統及退化生態系統中的AMF多樣性,表明AMF多樣性會隨著植被演替的進程而發生動態的變化[18-20],而喀斯特植被自然演替過程中AMF多樣性變化的研究仍然不夠深入,喀斯特生境中不同植被自然演替階段的土壤AMF多樣性概況如何？因此,本研究旨在通過高通量測序的方法,探究喀斯特不同植被自然演替過程中土壤AMF種質資源多樣性,為AMF在喀斯特石漠化生態恢復過程中采用菌根生物技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與土樣采集

本研究選取了3個典型喀斯特自然演替區域作為研究對象,其中,貴州貴陽市花溪區(簡稱花溪,106°27′—106°52′E,26°11′—26°34′N),為高原季風濕潤氣候；關嶺縣花江板貴鄉(簡稱花江,105°36′30″—105°46′30″E,25°39′13″—25°41′00″N),屬亞熱帶季風氣候；畢節市織金縣珠藏鎮(簡稱織金,105°44′42″—106°11′38″E,26°38′31″—26°52′35″N),屬亞熱帶季風氣候。在每個研究區根據植被類型的分布概況,以空間替代時間方法按植被演替方向選擇草本、灌木及喬木3種不同植被類型覆蓋的地段進行樣地設置,共9個樣地(每一樣地3個重復)。按喬木10 m×10 m、灌木5 m×10 m、草本2 m×2 m的樣方面積進行群落學調查,并按樣方對角線五點取樣法進行土壤樣品采集。采樣時挖取土壤剖面,每取樣點按5、10、15cm分層取樣,將各層土壤等量充分混勻裝入保鮮袋,分為兩份,一份用于理化性質測定,一份帶回實驗室置于-80℃超低溫冰箱中保存,送至北京諾禾致源測序公司檢測。研究樣地其他信息概況如表1。

表1 樣地概況Table 1 General situation of sample plots

HX：花溪,HuaXi；HJ：花江,HuaJiang；ZJ：織金,ZhiJing；T：喬木演替階段,Tree；B：灌木演替階段,Bush；H：草本演替階段,Herb

1.2 AMF Illumina HiSeq測序

1.2.1土樣基因組DNA提取和PCR擴增

采用SDS 方法對樣本基因組 DNA 進行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣品于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板,根據測序區域的選擇,使用帶 Barcode 的特異引物,New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,和高效高保真酶進行PCR。引物參照Beenhouwer[21]、Dai[22]、Geel[23]、Liang[24]、Xiang等[25]人提出的土壤AMF特異性引物,序列為：AMV4.5NF(F)—AAGCTCGTAGTTGAATTTCG、AMDGR(R)—CCCAACTATCCCTATT AATCAT,由諾禾致源公司合成。PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等量混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

1.2.2文庫構建和上機測序

使用TruSeq? DNA PCR—Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經過Qubit和Q—PCR定量,文庫合格后,使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2.3測序數據處理

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據,截去Barcode和引物序列后使用FLASH[26]對每個樣品的序列進行拼接,將得到的拼接序列經過嚴格過濾處理[27]得到高質量Tags數據,參照Qiime(Version 1.7.0)[28]的Tags質量控制流程。將經過以上處理后得到的Tags序列通過UCHIME Algorithm[29]與Unite database數據庫進行比對檢測嵌合體序列,去除其中的嵌合體序列[30],獲得最終有效數據。

1.2.4OTU聚類和物種注釋

利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001)[31]對所有樣品的全部有效數據進行聚類,默認以97%的一致性將序列聚類成為OTU(Operational Taxonomic Units),依據其算法原則,篩選OTU中出現頻數最高的序列作為OTU的代表序列。對OTU代表序列進行物種注釋,用Qiime軟件(Version 1.7.0)中的blast方法[32]與Unit數據庫[33]進行物種注釋分析,并分別在各個分類水平：phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)統計各樣本的AMF群落組成。使用MUSCLE[34]軟件進行快速多序列比對,得到所有OTU代表序列的系統發生關系。

1.3 土壤理化性質測定

采用常規方法測定土壤理化性質[35],其中,土壤 pH值酸度計法；速效鉀采用火焰分光光度法；有效磷采用鉬銻抗比色法；全磷采用鉬銻抗比色法；全氮和水解氮均用半微量開氏法；有機質用油浴加熱重鉻酸鉀氧化法測定(表2)。

表2 樣地理化性質Table 2 Physical and chemical properties of sample site

不同字母表示在5%的顯著性水平下有差異(P<0.05),a、b、c表示同一研究區不同演替階段間土壤理化性質的差異

1.4 統計分析

使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計算AMF多樣性指數；運用SPSS18.0單因素方差分析比較喬、灌、草階段之間多樣性指數間的差異,Spearman相關性分析描述AMF多樣性指數與土壤理化性質的相關性；采用Oringin8.0繪制柱狀堆積圖反映AM真菌豐度；運用R軟件進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)反映不同演替階段的AMF群落組成差異,典范對應分析(Canonical Correlation Analysis,CCA)反映土壤理化性質對AMF群落組成的影響。

2 結果與分析

2.1 采樣點土壤AMF分類

27個土壤樣本共得到3871個OTU,其中屬于AMF的OTU為275個。Silva數據庫進行比對共得到4目,其中球囊霉目Glomerales的OTU為249,多樣孢囊霉目Diversisporales的OTU為14個,原囊霉目Archaeosporales的OTU為10個,類球囊霉目Paraglomerales的OTU為2個。從4個目中共得到8科,13屬及19個分子AMF分子種。其中斗管囊霉屬Funneliformis1種、根孢囊霉屬Rhizophagus1種、硬囊霉屬Sclerocystis1種、隔球囊霉屬Septoglomus1種、近明球囊霉屬Claroideoglomus3種、巨孢囊霉屬Gigaspora1種、盾巨孢囊霉屬Scutellospora1種、無梗囊霉屬Acaulospora2種、多樣孢囊霉屬Diversispora3種、類球囊霉屬Paraglomus2種、雙型囊霉屬Ambispora1種、原囊霉屬Archaeospora1種、內養囊霉屬Entrophospora1種[36](表3)。

表3 AMF分子種分類情況Table 3 Classification of AMF molecular species

2.2 不同植被演替階段AMF屬與種水平OTU豐度及分布

花溪、花江、織金屬水平上AMF豐度分別為：喬木>灌木>草地、灌木>喬木>草地、草地>灌木>喬木,總體AMF豐度為花江>花溪>織金,且花江各樣地AMF豐度均高于其余各樣地豐度。各樣地優勢屬及次優勢屬均為根孢囊霉屬和斗管囊霉屬,花溪灌木第三優勢屬為硬囊霉屬,花江灌木和草本第三優勢屬為隔球囊霉屬,其余樣地第三優勢屬均為近明球囊霉屬(圖1)。

摩西斗管囊霉和Sclerocystissp.1 僅在花溪喬木、灌木、草地演替階段分布,可見是花溪特有種。縮隔球囊霉、根內根孢囊霉、Claroideoglomussp.MIB8381和稀有內養囊霉在各個樣地均有分布,可見是喀斯特地區的常見種。稍長無梗囊霉豐度在各種中最小,且僅在織金喬木及花江灌木演替階段分布。花溪、織金種水平上AMF豐度均為喬木>灌木>草地、而花江為喬木>草地>灌木。總體種豐度趨勢為：花江>花溪>織金(表4)。

表4 各樣地AMF分子種OTU豐度及分布Table 4 The abundance and molecular species of AMF OTU in sample site

續表

圖1 AMF屬水平OTU豐度Fig.1 The OTU abundance of AMF at the genus levelAM:叢枝菌根,arbuscular mycorrhizal；OTU：操作分類單元,operational taxonomic units；HXT：花溪喬木演替階段,HuaXi Tree；HXB：花溪灌木演替階段,HuaXi Bush；HXH：花溪草本演替階段,HuaXi Herb；HJT：花江喬木演替階段,HuaJiang Tree；HJB：花江灌木演替階段,HuaJiang Bush；HJH：花江草本演替階段,HuaJiang Herb；ZJT：織金喬木演替階段,ZhiJin Tree;ZJB：織金灌木演替階段,ZhiJin Bush；ZJH：織金草本演替階段,ZhiJin Herb

2.3 不同植被演替階段土壤AMF的OTU多樣性變化

所有采樣點測序文庫的覆蓋度均達到90%以上,說明絕大部分AMF序列可以被測出,測序結果具有較好的代表性,各樣地AMF多樣性指數均較高。在同一研究區不同演替階段,香農與辛普森指數變化趨勢基本一致,即在花溪和織金樣點：喬木≈灌木>草地,且花溪喬木和灌木與草地之間差異顯著(P<0.05),織金喬木與草地間差異顯著(P<0.05),說明花溪喬木和灌木AMF物種多樣性和常見種優勢度高于草地,織金喬木AMF物種多樣性和常見種優勢度高于草地；在花江樣點則為：草地>灌木>喬木,但是差異不顯著。花江喬、灌、草樣地的AMF 香農指數均大于花溪和織金草地的指數,且差異顯著(P<0.05),說明花江AMF物種多樣性大于花溪和織金草地演替階段。Chao1和ACE指數基本呈現一致的變化趨勢：花溪采樣點AMF群落豐度為喬木>灌木>草地,織金采樣點AMF群落豐度為灌木>喬木>草地,且差異均不顯著；而花江采樣點則為灌木≈草地>喬木,且差異顯著(P<0.05)。花江灌木和喬木演替階段分別擁有各樣地最高和最低的Chao1和ACE指數(表5)。

在同一演替階段不同研究區,喬木演替階段的AMF香農與辛普森指數變化趨勢為花溪≈織金>花江；草本演替階段為花江>花溪≈織金(P<0.05)；灌木演替階段基本一致。喬木演替階段AMF Chao1和ACE指數為花溪>花江≈織金(P<0.05),灌木和草本演替階段均為花江>花溪≈織金,Chao1指數差異顯著(P<0.05),ACE指數差異不顯著(表5)。

表5 不同演替階段AMF的OTU豐度與多樣性指數Table 5 AM fungal OTU richness and diversity index in different stage of succession

不同字母表示在5%的顯著性水平下有差異(P<0.05),a、b表示同一研究區不同演替階段間AMF豐富度與多樣性的差異,α,β,γ表示同一演替階段不同研究區間AMF豐富度與多樣性的差異；ACE：ACE指數,abundance-based coverage estimation index

2.4 不同植被演替階段AMF群落主成分分析

PCA分析表明各采樣點除織金喬木與草地演替階段外,其余各采樣點重復間的群落組成均差異較小。在同一研究區不同演替階段：花江草地與灌木演替階段AMF群落組成差異小,而喬木與草地和灌木間AMF群落組成差異大；花溪喬木與灌木演替階段AMF群落組成差異小,與草地演替階段差異大；織金喬、灌、草演替階段AMF群落組成差異均較大。在同一演替階段不同研究區：各研究區的喬木、灌木及草地演替階段均相隔較遠的距離,表明同一演替階段的不同研究區AMF群落組成均有較大差異(圖2)。

2.5 AMF群落多樣性與土壤理化性質相關性

AMF多樣性指數與環境因子的Spearman相關性分析表明：土壤全磷與ACE指數顯著負相關(P<0.05),且與Chao1指數極顯著負相關(P<0.01)；速效磷與香農和辛普森指數顯著負相關(P<0.05)；速效鉀與各多樣性指數呈現正相關關系,全氮和有機質與各多樣性指數呈現負相關關系,但差異均不顯著(表6)。

由土壤AMF OTU與理化性質的典型典范對應分析結果排序圖可知：第一主軸和第二主軸對AMF群落分布方差的解釋比例分別為30.4%和20.1%,兩者共解釋50.5%的方差變化。在第一主軸上,土壤pH、全磷和速效鉀為主要影響因子(相關系數為0.976、0.971、0.888)；在第二主軸上,土壤全氮、有機質、水解氮和速效磷為主要影響因子(相關系數分別為0.993、-0.887、-0.883和-0.812)。除土壤pH與速效磷外,其余理化性質均與AMF群落分布有顯著相關性,其中有機質為顯著相關(P<0.05),其余為極顯著相關(P<0.01)。土壤全氮與其余理化性質為負相關關系(圖3)。

表6 AMF多樣性指數與土壤理化性質的Spearman相關系數Table 6 Spearman′s correlation coefficient between AMF diversity and soil physicochemical property

圖2 不同演替階段PCA分析Fig.2 Analysis of PCA in different stage of succession

圖3 AMF群落與土壤理化性質CCA分析Fig.3 Canonical Correlation Analysis between AMF community and soil physicochemical propertyTN：全氮,Total nitrogen；TP：全磷,Total phosphorus；AK：速效鉀,Available kalium；AP：速效磷,Available phosphorus；HN：水解氮,Hydrolysis nitrogen；OM：有機質,Organic matter

3 結論與討論

本研究從基因水平上考察了3個典型喀斯特區域不同自然演替階段的AMF多樣性,結果表明各樣地均有較高的AMF多樣性,種屬水平的AMF豐度變化趨勢均為花江>花溪>織金,且各樣地優勢屬均為根孢囊霉屬,該結果與本研究所用形態學方法及大多數文獻所報道的結果有一定的差異[13]。魏源等[15]利用巢式PCR與變性梯度凝膠電泳相結合的分子生物學方法,表明球囊霉屬(Glomus)極有可能是喀斯特地區AMF的優勢菌屬,Likar等[37]研究喀斯特土壤中的AMF多樣性及其分布,同樣發現球囊霉屬是喀斯特生境中穩定存在的優勢屬。有學者曾在其研究中分別采用形態學鑒定、定量PCR與PCR-DGGE及454高通量測序技術對長期不同施肥作用下的土壤AMF群落結構及物種多樣性進行研究,結果發現不同方法所得的次優勢屬種以及所鑒定的種屬數目均有所差異,因此,產生差異的原因可能與不同方法本身的優劣性及分辨率有一定的關系[38]。

AMF通過菌絲網絡調節植被群落結構及演替,從而影響生態系統穩定及功能[39]。劉永俊等[40]及Zangrao等[41]研究結果均表明：不同演替階段AMF多樣性會隨著植物演替進行而降低,與本研究中花江研究區AMF多樣性變化趨勢一致(表4),而花溪和織金研究區的AMF多樣性卻隨著演替進行而增加。其原因可能是：(1)本文的研究對象是自然演替過程中的土壤AMF多樣性,植物群落及多樣性均有較大差異(表1),而劉永俊等研究反映的是以檸條為優勢物種的人工植被演替生態系統中侵染了檸條根系的AMF多樣性,植物多樣性則十分匱乏,鐘凱等[42]對泰山植被根圍AMF群落結構、數量、組成及植物多樣性研究發現,植物多樣性對于提高AMF多樣性發揮極為重要的作用,Hiiesalu等[43]在其研究中也指出AMF物種豐度與植物物種豐度呈顯著正相關關系。(2)Zangrao等采用形態學方法研究AMF多樣性,但不同種類AMF的產孢能力不同,且AMF的侵染能力也存在很大差異,可能不能真實地反映土壤中的AMF多樣性[38]。本研究所選3個研究區所呈現的不同演替階段AMF多樣性變化趨勢不一,其原因可能與各研究區有一定的地理距離相關,Xu等[44]研究結果表明地理距離解釋了AMF的系統發育格局,AMF群落組成會受到擴散限制值的影響。

已有研究表明,AMF豐度及多樣性會隨著土壤養分的供應情況發生變化,土壤理化性質對AMF群落結構及多樣性有重要影響[45-46]。本研究結果顯示土壤全磷與AMF豐富度指數顯著負相關,速效磷與AMF多樣性指數顯著負相關,表明土壤全磷和速效磷是影響AMF豐度和多樣性的主導因子,該結果與梁月明等[47-48]研究結果一致,而楊春雪等[49]研究表明土壤全磷與AMF物種豐度呈顯著正相關關系,有學者曾指出,一定范圍內的低量速效磷會促進AMF的生長,而過高的速效磷含量會抑制AMF的生長及發育[50-51]。CCA分析表明土壤全氮、水解氮、有機質、全磷和速效鉀對AMF群落影響差異顯著,pH卻差異不顯著,該結果與張玉潔等[52]認為土壤pH為影響AMF多樣性的主要土壤因子不一致,導致該結果的原因可能與土壤本身固有屬性有關,成土母質及元素組成決定了pH值的相似性,在同一區域的土壤類型,其pH值空間變異性較低[53],從而對AMF多樣性沒有顯著影響。