生物炭對杉木人工林土壤養分、酶活性及細菌性質的影響

胡華英,殷丹陽,曹 升,張 虹,周垂帆,3,*,何宗明

1 福建農林大學林學院,福州 350002 2 國家林業和草原局杉木工程研究中心,福州 350002 3 福建長汀紅壤丘陵生態系統國家定位觀測研究站，龍巖 366300

杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb．)Hook．]是重要速生用材樹種,廣泛分布于我國南方地區,在亞熱帶森林生態系統中占有十分重要的地位,然而杉木連栽地力衰退日趨突出,土壤性質退化,肥力和林分生產力下降,土壤酶活性逐漸下降[1],土壤細菌群落多樣性低下[2],對森林生態系統產生不利影響,嚴重威脅南方地區人工林的可持續經營。近年來有研究發現,添加生物炭能夠改善土壤團聚體結構和土壤理化性質,提高土壤肥力[3],能夠提供土壤細菌適宜的棲息環境,刺激土壤細菌功能和群落多樣性的變化[4],還可以影響土壤酶活性[5]。Lehmann等[6]表示對土壤添加生物炭能夠促進細菌與其他菌根形成共生體,對改善土壤生態系統中細菌多樣性具有潛在的重要作用；Yang等[7]研究發現生物炭一方面可以為土壤細菌提供豐富的營養物質,另一方面為細菌提供適宜的庇護環境,從而能夠促進土壤細菌的相對豐度；Oleszczuk等[5]通過對蔬菜地土壤添加生物炭發現,生物炭對酶活性具有保護作用,能夠提高土壤中大部分酶的活性；鄒春嬌等[8]研究發現,生物炭處理能顯著增加黃瓜連作營養基質中的酶活性,并且對微生物數量及群落結構也有明顯的調節作用；Xie等[9]研究發現,對土壤添加生物炭能夠增加土壤C、N含量,降低尿素氮,從而促進土壤養分循環和作物生長。因此,開展對土壤生物炭的環境效應研究,對改良土壤理化性質及提高土壤肥力,提升林木生產力等,都具有重要的理論和實踐指導意義。但目前這些研究多聚焦于于農業土壤,而生物炭對林地土壤改良的研究報道國內并不多見,特別是生物炭對南方紅壤杉木人工林細菌多樣性、酶活性以及養分方面的作用機制的研究鮮有報道,這極大限制了生物炭在林業生產當中的應用,就亟需大量添加不同生物炭對紅壤性質、細菌及酶活性影響的研究數據,以揭示杉木人工林土壤養分含量、細菌相對豐度及酶活性之間的相關關系。

有鑒于此,本文基于高通量測序技術,通過添加不同生物炭對人工杉木林土壤環境中細菌群落進行培養和測定,同時挑選與土壤C、N循環相關的土壤-α-葡萄糖苷酶、土壤-β-葡萄糖苷酶、土壤過氧化氫酶及土壤脲酶,分析四種酶活性與土壤養分含量及土壤細菌相對豐度的關系。通過研究添加生物炭對土壤細菌多樣性及酶活性的影響,能夠明確生物炭對杉木人工林土壤微生物群落結構的作用,更加準確地分析酶活性與土壤養分含量及細菌相對豐度之間的作用機制,為生物炭在南方酸性林地土壤的合理利用提供依據,對提高林木生產能力等具有重要的科學價值和現實意義。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區三明市位于福建省中西北部,年平均氣溫19.4℃,年平均降水量1500.7mm,相對濕度79%,日照率44%,土壤類型為山地紅壤(富鋁濕潤富鐵土),研究所用土壤采自三明市福建農林大學莘口教學林場(118°47′E,26°28′N),為二代杉木人工林土壤,在20m×20m的樣方內按S形取多點0—20cm的土壤樣品,混合鮮土過2mm篩之后風干保存,供土壤培養實驗。杉木林土壤全磷(321±72.9)mg/kg、有效磷(14.03±2.42)mg/kg、pH(4.34±0.06)、全氮(1.83±0.20)g/kg、全鉀(23.83±3.01)g/kg。

1.2 生物炭制備和性質

原料采自杉木樹干和樹葉,洗滌烘干粉碎后過1mm篩,置于馬弗爐中進行厭氧熱解,以20℃/min的速率分別加熱至300℃、600℃,熱解持續時間為4h,熱解結束待其自然冷卻至室溫后置于棕色瓶中[10],得到4種生物炭,即300℃杉葉炭(BL300)、600℃杉葉炭(BL600)、300℃木屑炭(BW300)及600℃木屑炭(BW600)。制備完成后的生物炭測定其pH值(分別為7.33、10.41、4.05、7.96)、灰分(分別為9.9%、22.2%、1%、2.7%)、有效磷(分別為2568、3604、228、615mg/kg)、全碳(分別為563.1、592.6、592.4、676.6 mg/kg)、全氮(分別為15.7、12.8、3.9、3.5 mg/kg)等理化性質。

1.3 實驗處理

向土壤中分別添加1%、3%比例的四種生物炭培養80天,設置9個處理：1)未處理土壤CK、2)土壤加1% BL300、3)土壤加3% BL300、4)土壤加1% BL600、5)土壤加3% BL600、6)土壤加1% BW300、7)土壤加3% BW300、8)土壤加1% BW600、9)土壤加3% BW600,每個處理設置3個重復。設置黑暗、25℃培養,培養期間每隔2—3d稱重補水,使土壤水分保持在田間持水量的60%,培養時間為80天。

1.4 土壤理化性質測定方法

1.5 土壤酶活性測定方法

1.6 土壤微生物測定方法

細菌豐度及多樣性的測定樣本取自培養實驗第80天的土壤,選取添加量為3%的4種的生物炭處理和對照土壤進行測定,每個處理設置3個重復。16S rDNA PCR產物高通量測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成,從樣本中提取基因組DNA后,用帶有barcode的特異引物擴增16S rDNA的V3+V4區。引物序列為341F(CCTACGGGNGGCWGCAG),06R(GGACTACHVGGGTATCTAAT)；擴增體系為50 μL反應體系中包含5 μL的10× KOD Buffer,5 μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL的KOD聚合酶和100 ng模版 DNA；擴增條件為95 °C預變性2min,隨后 98 °C 變性10 s,62 °C 退火 30 s,68 °C 延伸30 s,共27個循環,最后68 °C 延伸10min,然后將PCR擴增產物切膠回收,用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合,連接測序接頭,根據Illumina官方說明構建測序文庫,Hiseq2500的PE250模式上機測序,測定土壤細菌群落的相對豐度。

1.7 數據處理分析

土壤細菌測序得到原始數據后,對原始數據的reads利用、tags拼接等多個過程進行質控,根據PE reads之間的重疊關系,使用FLASH(v 1.2.11)將成對雙端reads拼接為一條序列。拼接后的Raw Tags經過更嚴格的過濾處理得到高質量的Tags數據,并進行Tags截取、長度過濾等操作[14]。最后對處理后得到的Tags序列與數據庫進行比對檢測嵌合體序列[15],去除其中的嵌合體序列[16],得到最終的有效數據。測得土壤養分性質和土壤酶活性原始數據,通過Excel 2003整理數據,采用SPSS 19.0軟件對土壤基本性質、酶活性實驗數據進行單因素方差分析和SNK法進行顯著性檢驗,得到數據均值及誤差,運用雙變量相關將土壤性質和酶活性及細菌相對豐度數據做相關性分析,運用Origin 8.5繪制土壤基本養分和酶活性柱狀圖,利用Canoco 4.5對土壤性質和養分含量及土壤細菌群落相對豐度做冗余分析(RDA),得到其中的相關關系。

2 結果與分析

2.1 生物炭對土壤化學性質影響

圖1 不同生物炭處理土壤pH及養分變化Fig.1 Changes of soil pH and nutrients in different biochar treatmentsBL300：300℃杉葉炭處理；BL600：600℃杉葉炭處理；BW300：300℃木屑炭處理；BW600：600℃木屑炭處理

對培養80天的土壤測定理化性質,如圖1所示,土壤全磷、有效磷、速效鉀含量的變化趨勢總體表現出相似性,杉葉炭處理之間變化顯著,BL600處理顯著高于BL300處理,且隨著生物炭添加量增加而升高,而木屑炭處理變化不顯著。所有處理的土壤pH值介于3.97—5.54之間,與對照相比,1%生物炭添加量的BL600比對照大,其他1%添加量均小于對照,其中1% BW300比對照低0.26,除了BW300其他3%生物炭添加量均大于對照,3%添加量的BL600處理的pH值高達5.54,比對照高出1.31,說明土壤pH值隨著生物炭添加量增加而升高。添加生物炭后,土壤銨態氮含量隨生物炭施用比例的增加而顯著降低,各處理間變化顯著,較小施用量條件下銨態氮含量增幅較為明顯,兩種形態的氮含量大致呈相反的趨勢。添加生物炭后使土壤全碳含量均顯著高于對照,且隨生物炭施用比例的增加而顯著提高,其中以3%添加量的BW600土壤全碳含量為最高,達到了44.3g/kg；而土壤溶解性有機碳含量并無明顯變化規律,僅隨生物炭添加量的增加大致呈降低的趨勢。

2.2 生物炭對土壤酶活性影響

對添加不同生物炭所測得的4種酶活性變化進行分析,如圖2所示,除了3%添加量的BW600表現為抑制,添加其他生物炭提高土壤-α-葡萄糖苷酶活性,在杉葉炭處理中1%添加量BL600高于BL300,且低添加量的酶活性大于高添加量；與對土壤-α-葡萄糖苷酶的活性影響不同,除了3%添加量的BL600和BW300表現為抑制,添加其他生物炭提高土壤-β-葡萄糖苷酶活性,其中杉葉炭中,低添加量酶活性大于高添加量,而添加木屑炭的土壤-β-葡萄糖苷酶活性變化規律不明顯；添加生物炭對土壤過氧化氫酶活性影響不大,各處理酶活性相對一致；添加生物炭對脲酶活性大致表現為提高的趨勢,且隨添加量的增大而提高,其中3%添加量的BL600達到了極顯著水平(208.13 μmol d-1g-1),而其他生物炭處理的土壤酶活性變化相對較小。

圖2 不同生物炭處理對土壤酶活性影響Fig.2 Effects of different biochar treatments on soil enzyme activities

2.3 生物炭對土壤細菌豐度及結構的影響

土壤細菌群落shannon指數箱線圖可以直觀的反映添加不同生物炭后土壤細菌多樣性的中位數、最大值、最小值及異常值等,如圖3所示,不同處理表現出的結果有所差異,通過中位數可以看出,添加不同生物炭土壤細菌豐度BL300>BL600>CK>BW300>BW600,與對照相比,添加杉葉炭顯著提升了土壤細菌豐度,添加木屑炭則抑制了土壤細菌類群的豐度；且添加300℃制備生物炭的土壤細菌豐度要高于600℃生物炭,其中BL300的土壤細菌豐度最大,而BW600的土壤細菌豐度最小；由圖中還可以看出BL300、BW300測定的細菌豐度較為均勻、誤差較小,而另外3種處理最大值和最小值相差較大從而誤差較大。

圖3 不同生物炭處理細菌群落shannon指數箱線圖Fig.3 Shannon index box diagram of bacteria communities under different biochar treatments

選取土壤細菌優勢種的部分分類單元,構建土壤細菌的系統發育分類樹,可以清晰地看出土壤細菌群落不同分類水平上的結構和相對豐度,圖4中從左到右的列分別代表由門到種的不同分類水平,各個餅圖中不同的顏色的區域代表不同的處理在該分類單元上的比率,半徑的大小代表該分類單元所包含的物種豐度,半徑越大代表物種豐度越高。在門分類水平上的土壤優勢菌中,放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)在添加杉葉炭中占比例較低,而在木屑炭中占比較高；浮霉菌門(Planctomycetes)在添加BL600中占含量較高；變形菌門(Proteobacteria)在添加BL300占含量較高。在綱分類水平上的優勢菌中,添加BL600的土壤中放線菌綱(Actinobacteria)和纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)的含量較低,而在其他細菌中所占的含量較高,其他處理中細菌相對豐度差異不顯著；在屬分類水平上的優勢菌中,嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)在添加杉葉炭中占含量極低,在添加木屑炭處理中含量較高,其中在BL600含量最低,而BW300中含量最高,中華單胞菌屬(Sinomonas)在BW300中相對豐度最高。

圖4 不同生物炭處理下土壤細菌系統分類樹Fig.4 Soil bacterial taxonomy tree under different biochar treatments

2.4 土壤養分、酶活性及細菌豐度之間的冗余分析

對土壤性質與土壤酶活性及細菌優勢物種豐度進行冗余分析,如圖5所示,a圖代表土壤性質與門分類水平上土壤細菌及酶活性的冗余分析,b圖代表土壤性質與屬分類水平上土壤細菌及酶活性的冗余分析,粗線箭頭代表土壤性質及化學組分含量,箭頭越長代表影響越顯著,可見土壤pH、全磷、硝態氮、銨態氮及DOC含量為主要影響因子,而全碳、有效磷及速效鉀對土壤細菌的影響較小；細線箭頭代表土壤4種酶活性和在不同分類水平上土壤優勢細菌群落的相對豐度,影響因子與細菌種群夾角越接近0°代表兩者呈正相關越顯著,夾角越接近180°代表兩者呈負相關越顯著。由a圖可以看出,土壤性質和化學成分與酶活性及細菌群落三者具有顯著的相關關系,其中土壤銨態氮和溶解性有機碳與放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)及放線菌門(Actinobacteria)等顯著正相關,而與土壤脲酶、浮霉菌門(Planctomycetes)及疣微菌門(Verrucomicrobia)等呈顯著負相關,土壤全碳與土壤-β-葡萄糖苷酶及土壤過氧化氫酶呈負相關。b圖顯示,pH、速效鉀、全磷及有效磷含量與嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)豐度呈顯著負相關,與浮游菌屬(Planctomyces)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)及土壤脲酶呈顯著正相關,土壤硝態氮含量與中華單胞菌屬(Sinomonas)、土壤-α-葡萄糖苷酶及土壤過氧化氫酶呈負相關,而與土壤-β-葡萄糖苷酶及伯克氏菌屬(Burkholderia-Paraburkholderia)呈正相關,土壤全碳含量與外桿菌屬(Exiguobacterium)呈正相關關系。

3 討論

3.1 生物炭對土壤養分的影響

關于添加生物炭影響土壤理化性質的研究已經引起研究學者的廣泛關注,本研究中添加生物炭改變了土壤化學性質,其中添加杉葉炭顯著提高了土壤pH值、土壤全磷、有效磷、速效鉀等的含量,添加木屑炭提高了土壤全碳含量,且隨著添加量的增加而升高；由于1%生物炭添加量較低,所以引起的土壤養分的變化較高添加量不顯著；與高溫炭相比,低溫炭對土壤DOC的提高較為顯著；添加生物炭降低了土壤銨態氮的含量,而增加了硝態氮含量,說明硝態氮與銨態氮之間相互轉化,其中杉葉炭降低更為顯著,說明制備原材料和溫度不同的生物炭對土壤性質的影響程度存在一定的差異。這一結果和Novak等[17]的的報道相似,他們研究發現添加生物炭能夠有效提高土壤速效氮、磷、鉀含量,Van等[18]認為生物炭的pH值大多呈堿性,灰分含量較高,可以降低土壤中交換性氫離子含量,從而添加生物炭能夠提高土壤pH值,與本研究結果相似。不同的制備原料和熱解溫度對生物炭的性質具有很大的影響[19],通過對生物炭的物質含量測定可知,杉葉炭的pH、灰分含量、有效磷等明顯高于木屑炭,因此添加杉葉炭對土壤pH值、全磷、有效磷、速效鉀含量提高更顯著,而木屑炭的碳含量更高,從而能夠更顯著提高土壤全碳含量。

圖5 土壤性質與酶活性及細菌相對豐度相關分析Fig.5 Correlation analysis between soil propertiesand enzyme activity and relative abundance of bacteriaa圖代表土壤性質與門分類水平上土壤細菌及酶活性的冗余分析,b圖代表土壤性質與屬分類水平上土壤細菌及酶活性的冗余分析,TP：全磷；AP：有效磷；AK：速效鉀；硝態氮；銨態氮；DOC：可溶性有機碳；TC：全碳，TN：全氮；S-a-GC：土壤-α-葡萄糖苷酶；S-b-GC：土壤-β-葡萄糖苷酶；S-C：土壤過氧化氫酶；S-UE：土壤脲酶；Act：放線菌門Actinobacteria；Chlo：綠彎菌門 Chloroflexi；Pro：變形菌門 Proteobacteria；Firm：厚壁菌門 Firmicutes；Pla：浮霉菌門 lanctomycetes；Acido：酸桿菌門 Acidobacteria；Ver：疣微菌門 Verrucomicrobia；Sac：糖菌門 Saccharibacteria；Bact：擬桿菌門 Bacteroidetes；Pla：浮游菌屬 Planctomyces；Sph：鞘脂單胞菌屬 Sphingomonas；Kte：纖線桿菌屬 Ktedonobacter；Exi：外桿菌屬 Exiguobacterium；Aci：嗜酸棲熱菌屬 Acidothermus；Sin：中華單胞菌屬 Sinomonas；Bur：伯克氏菌屬 Burkholderia-Paraburkholderia

3.2 生物炭對土壤酶活性的影響

生物炭由于其自身獨特的性質,添加后對土壤理化性質產生了一定的影響,并且在一定程度上也使得土壤酶活性發生了變化。添加生物炭整體促進了土壤-α-葡萄糖苷酶、土壤-β-葡萄糖苷酶及脲酶的活性,低添加量對葡萄糖苷酶的提高作用大于高添加量,高添加量對土壤脲酶的提高作用大于低添加量,而生物炭對土壤過氧化氫酶的影響不顯著。Wang等[20]研究表明,低添加量的生物炭(質量分數為0.5%)可以提高參與C循環的土壤酶活性,高添加量的生物炭則降低其活性,而與N循環有關的土壤脲酶活性隨著生物炭添加量的增加而提高,與本研究結果相印證。馮愛青等[21]表明在棕壤土中添加玉米秸稈生物炭能夠提高土壤脲酶活性,卻抑制了土壤過氧化氫酶活性,而本文中生物炭土壤過氧化氫酶的影響不顯著。有研究發現,添加生物炭能夠吸附植物根系土壤中反應底物,促進土壤酶活性；相反,添加生物炭也能夠吸附土壤中的酶分子,對酶促反應結合位點形成保護作用,抑制土壤酶活性[22]。由于不同生物炭的組分和吸附具有特異性,不同土壤酶活性對添加生物炭的響應并非單一的促進或者抑制作用,土壤酶活性的改變程度主要受自身性質和生物炭性質及添加量的影響。

3.3 生物炭對土壤細菌群落結構及多樣性的影響

添加生物炭對土壤細菌群落結構及多樣性也具有一定的影響,添加杉葉炭能夠提高土壤細菌豐度,而木屑炭對土壤細菌生長有一定的抑制作用,且添加低溫炭的土壤細菌豐度大于高溫炭,這與Liao等[23]研究結果一致,生物炭具有較大的比表面積和孔隙結構,為土壤細菌提供了有利的繁殖場所,并含有豐富C、N、P、K等營養物質,對土壤細菌的生長和相對豐度產生有利作用,也有研究發現添加有些生物炭抑制部分細菌的生長和繁殖,致群落多樣性指數減小,有些木質原料制備的生物炭可利用性營養物質較低,氮素不足而不能支撐細菌生長代謝過程,從而降低細菌相對豐度[24],這些發現與本研究結果相似,添加杉葉炭對土壤營養物質的提高更顯著,從而能夠提高土壤細菌豐度和群落多樣性,而木屑炭降低了土壤細菌豐度和群落多樣性。Zhang等[25]通過添加300℃和700℃生物炭,發現土壤溶解性有機碳(DOC)在300℃生物炭處理時呈增加趨勢,而700℃生物炭會降低DOC含量,因此印證了本文的實驗結果,添加低溫炭培養后土壤DOC含量大于高溫炭,所以添加低溫炭土壤細菌豐度大于高溫炭。生物炭相對穩定,土壤細菌并不容易分解利用,從本文看出,由于生物炭本身的特性,添加生物炭后,直接對土壤pH,N、P、K等養分含量產生影響,可見生物炭是通過改變土壤性質間接影響土壤細菌群落結構及多樣性。

3.4 生物炭處理土壤養分、酶活性及細菌豐度之間關系分析

土壤酶主要由土壤微生物、動植物及殘體分泌,其中土壤微生物中的土壤細菌和放線菌等是土壤酶的主要來源,可見土壤酶活性與細菌存在直接相關關系[20],劉善江等[26]指出,酶是各種生化反應的催化劑,也是土壤細菌活性的表現,同時土壤微生物又是土壤酶的影響因素,印證本文結果,土壤細菌與酶活性有密切的聯系。土壤細菌及放線菌產生大量的酶,其活力受到土壤物理狀態和營養元素含量等的影響[17],從而土壤酶活性與土壤性質及養分有密切的關系。添加生物炭改變土壤pH值和營養元素含量,直接或間接影響土壤細菌群落結構及多樣性,進一步影響了土壤酶活性。有研究證明,高pH值和灰分含量的生物炭施入土壤后,有機陰離子(—O—和—COO—)和無機碳酸鹽增加,從而提高土壤pH值[18],本研究中杉葉炭本身具有更高的pH值和灰分含量,添加后比木屑炭提高土壤pH更顯著；由于嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)是一種喜酸細菌,其相對豐度隨著土壤pH的升高而降低,從而添加木屑炭使嗜酸棲熱菌屬豐度相對提高,而添加杉葉炭使嗜酸棲熱菌屬豐度降低；土壤疣微菌門(Verrucomicrobia)能夠分泌一些與硝化作用有關的酶,促進硝態氮分解轉化為銨態氮,故疣微菌與土壤銨態氮呈負相關而與硝態氮呈正相關；木屑炭中由于含有纖維素及復雜芳香物質較多而導致含碳量較高,放線菌分泌的胞外酶可以促進降解纖維素及復雜芳香物質,因此添加木屑炭能夠提高土壤放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度；土壤細菌改變能夠引起酶活性的變化,因此添加生物炭對土壤細菌群落結構及多樣性和酶活性的影響呈顯著的正負相關。但圖中有些土壤酶與土壤養分及細菌群落關系不顯著,這可能是因為土壤細菌種類繁多且作用方式有差異,或者該土壤酶的影響因素還有其他真菌或動植物。

4 結論

由于生物炭自身的性質和物質含量能夠改變土壤pH值及全磷、有效磷、速效鉀等養分含量,其中杉葉炭高于木屑炭,而添加木屑炭土壤全碳含量高于杉葉炭；生物炭能夠促進土壤葡萄糖苷酶及脲酶的活性,其中低添加量提高程度更顯著,對過氧化氫酶的影響不大,與N循環有關的土壤脲酶活性隨著生物炭添加量的增加而提高；添加杉葉炭能夠提高土壤細菌豐度,而木屑炭降低了土壤細菌豐度,添加低溫炭土壤細菌豐度大于高溫炭；添加生物炭對土壤pH值、全碳、全磷、有效磷、速效鉀含量等具有直接影響,土壤組分和性質對不同細菌種群生活習性與功能產生不同的影響,細菌群落的變化又會引起土壤酶活性的改變,因此土壤養分含量、酶活性和細菌群落相對豐度具有密切的聯系,對生物炭的添加存在規律性的響應。