一起兔球蟲病和大腸桿菌病混合感染的診斷及大腸桿菌藥敏試驗分析

張 沛，闞 威，張總超，馬艷萍，王謝忠，孫生禎，劉蓉婧，游蕭倩，拉 華，張茂華，魏夢君，黃 龍，俞慧民，王云平*

（1.青海省動物疫病預防控制中心，青海西寧810000；2.青海省樂都區動物疫病預防控制中心，青海互助810700）

近年來兔球蟲病和大腸桿菌病的混合感染病頻頻爆發,兩病的混合感染使病情復雜化,病死率增高，給養兔業造成嚴重的經濟損失。兔球蟲病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于兔的腸上皮細胞和肝膽管上皮細胞內的一種寄生蟲病,是家兔養殖中最常見的寄生蟲病之一。按球蟲的種類和寄生部位不同可將兔球蟲病分為肝型、腸型和混合型，臨床常已混合型為主，表現為頑固性下痢、腹瀉帶血、腹圍增大、下垂，其主要侵害6月齡以內兔，感染率可達100%，其中對1～3月齡的兔侵害最嚴重，死亡率可高達80%[1]。而兔大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的兔敗血型感染和腹瀉傳染病，表現為黏液性腸炎、腸毒血癥或組織器官炎癥等。臨床主要以下痢和流涎為特征，主要發生于1～4月齡仔兔。當飼養管理不當、氣候環境突變或患某些傳染病、寄生蟲病引起抵抗力低下時發病，該病可經消化道傳播引起大批死亡[2]。

2018年9月底至10月初，青海省樂都區某兔專業養殖合作社兔發生了以拉稀、腹部臌脹、消瘦、呼吸困難等癥狀為主的疫情,并陸續出現死亡，病程多在1～2 天。通過了解發病情況，送檢瀕死期兔臨床癥狀觀察，死亡兔剖檢變化和實驗室診斷，為盡快確診并及時控制疫情，對病死兔進行了細菌分離鑒定和糞便蟲卵檢查，并通過動物試驗確定其毒力，最終確診為球蟲病與大腸桿菌病混合感染。同時對分離株細菌進行了藥敏試驗，以便對樂都區兔大腸桿菌的臨床診斷和抗菌藥物治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢材料

送檢已死亡和瀕死期兔各1 只。剖檢檢測已死亡兔，并無菌采集心、肝、脾、肺等臟器和糞便作為試驗檢測病料；對瀕死期兔進行臨床觀察。

1.1.2 主要試劑和設備

試劑：營養瓊脂培養基、血瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、HE 瓊脂培養基、K-B 法藥敏紙片（26 種）；細菌微量生化鑒定管，0.5 麥氏比濁管，均購自于杭州微生物試劑有限公司；DNA 提取試劑盒、2000DNA Marker、PCR 反應預混酶、50×TAE、瓊脂糖，購自于北京全式金公司。

設備：顯微鏡、恒溫培養箱、PCR 擴增儀(Bio-RAD，Mexico)，凝膠成像系統（Bio-RAD，USA），水浴恒溫振蕩器，DYY-12 型電腦三恒多用電泳儀與DYCP-31A 型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.1.3 試驗動物

18g～22g SPF 級小鼠，購自青海大學實驗動物中心。

1.1.4 引物合成

參考已發表的文獻[3]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成細菌鑒定用通用引物16S rRNA基因引物，引物序列及大小，見下表1。

表1 16S rRNA 基因PCR 擴增引物

1.2 方法

1.2.1 病料觸片鏡檢和糞便蟲卵檢查

將剖檢兔采集的病料組織心、肝、肺病理變化部位觸片后進行革蘭氏染色鏡檢。

取新鮮兔糞5～10g 放入杯中，先加少量飽和鹽水將兔糞搗爛混勻，再加飽和鹽水至50ml。將此糞液用60 目尼龍網過濾于試管（15㎜×150㎜），在試管凸液面覆蓋蓋玻片，靜止15～30 分鐘，球蟲卵即浮于凸液面，隨即取下蓋玻片置于載玻片上，在顯微鏡10X40 倍觀察。

1.2.2 小動物試驗

將采集的病料組織（心、肝、肺）分別接種營養肉湯增菌培養，取其24 小時培養物，分別腹腔接種18～22gSPF 級小鼠4 只，每只0.2ml；同時取4 只同級別小鼠注射等量無菌生理鹽水作為對照，隔離飼養觀察。

1.2.3 病原分離培養

無菌采集死亡小鼠的心臟、肝臟、肺臟等臟器觸片革蘭氏染色鏡檢，并將病料接種于營養肉湯增菌；取24h 的肺臟增菌營養肉湯培養物劃線接種于營養瓊脂平板進行純化培養；純化菌落劃線接種于血瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、HE 瓊脂平板，37℃24h 培養后觀察菌落形態；隨機挑選疑似目標單菌落接種于營養肉湯，培養24h，涂片革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 生化鑒定

參考《獸醫微生物》第四版4，腸桿菌科生化特性鑒定表，詳見下表2。將血清肉湯24h 培養物，按照杭州微生物試劑有限公司《腸桿菌科細菌生化鑒定管說明書》，接種于生化反應管，觀察反應結果。

表2 大腸桿菌生理生化指標

1.2.5 16S rRNA 基因PCR 擴增及測序

取純化后營養肉湯培養物，按照細菌DNA提取試劑盒說明書，提取細菌基因組作為PCR 反應模板。

16 S rRNA 基因PCR 擴增：16S rRNA 條帶大小為194bp，PCR 擴增體系為50μl：PCR 預混酶25μl，上下游引物各1μl，DNA 模板2μl，雙蒸水21μl。PCR 擴增條件為：PCR 擴增條件為，95℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30 個 循環；72℃10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

目的條帶的PCR 產物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI 數據庫中進行Blast 比對分析，并應用MEGA5.1 軟件對16S rRNA 基因序列進行同源性分析及系統進化樹的構建。

1.2.6 藥敏試驗

藥敏試驗采用Kirby—Bauer 法。挑取單個菌落接種于MH 液體培養基中，37℃培樣16h，調整菌液濃度相當于0.5麥氏單位（1.0 ×108CFU/ml）。用移液器移取200μL，用涂菌棒均勻涂布于M-H 瓊脂平板上，等培養基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養基表面，于37℃培養24h，游標卡尺測定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準判定分離菌對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 病死兔剖檢和瀕死期兔臨床觀察結果

對1 只已死亡兔進行剖檢，可見胃膨大，充滿多量液體和氣體，腸壁血管充血和管壁透明菲薄、十二指腸擴張，腸道漿膜充血、出血、水腫，盲腸氣腫和黏膜充血、出血；肝臟腫大，有小點狀壞死灶，膽囊充盈；肺臟心臟、腎臟未見異常變化。對1 只瀕死期兔臨床觀察，可見病兔精神沉郁，伏臥不動，身體消瘦、腹部脹氣狀；肛門周圍、后肢等部位皮毛被糞便沾濕，呈黃色，體溫升高到41.2℃；送檢第4 天死亡。

2.2 病料鏡檢和糞便蟲卵檢查結果

病料中均可檢出革蘭氏陰性直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對。

圖1 病料心臟革蘭氏染色

圖2 病料肺臟革蘭氏染色

圖3 病料肝臟革蘭氏染色

糞便經飽和鹽水漂浮法檢測，在顯微鏡1 個視野下可見10～20 個大小不等和形態不一的球蟲蟲卵。

2.3 動物試驗結果

病料組織24h 增菌培養物，分別腹腔接種4只小鼠，于接種后24h 內死亡；對照組4 只小鼠72h 內健活。由此說明分離株細菌毒力較強。

2.4 病原分離培養及菌落形態特征

死亡小鼠心臟、肝臟、肺臟，觸片革蘭氏染色鏡檢，見下圖Y。

圖4 鼠心臟觸片革蘭氏染色

圖5 鼠肝臟觸片革蘭氏染色

圖6 鼠肺臟觸片革蘭氏染色

純化細菌單菌落在營養瓊脂平板菌落呈圓形隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明光澤的菌落；在伊紅美藍瓊脂平板上呈帶金屬光澤的紫黑色菌落；HE 瓊脂平板上呈橘黃色菌落；血瓊脂平板上無溶血現象。詳見下圖X。

圖7 純化細菌營養瓊脂培養特性

圖8 純化細菌伊紅美藍瓊脂培養特性

圖9 純化細菌HE瓊脂培養特性

圖10 純化細菌血瓊脂培養特性

2.5 生化鑒定結果

表3 兔分離株大腸桿菌生化鑒定試驗結果統計

2.6 16S rRNA 基因擴增結果

圖11 分離株細菌16S rRNA PCR 擴增結果

2.7 16S rRNA 基因同源性及系統發育分析結果

對分離菌株細菌16S rRNA 基因進行測序，測序結果顯示：分離株細菌的16S rRNA 基因序列在線Blast 分析顯示，其16S rRNA 基因序列與GenBank上已登錄(AccessionNo：NR114042、NR112558、NR024570) 的大腸桿菌的相應序列具有高度同源性≥99.0%)；

根據16S rRNA 基因序列與上述同源性較高的大腸桿菌相應序列建立系統進化樹，由圖12可見，分離株與其同源較高的3 株菌形成了2 個獨立分支，且（AccessionNo：NR114042、NR112558、NR024570)3 株菌處在同一分支，而分離株單獨處一個大的分支。

圖12 分離株大腸桿菌16S rRNA 基因同源性及系統發育分析結果

2.8 藥敏試驗結果

由上表可見，分離株大腸桿菌對丁胺卡那霉素、呋喃唑酮、慶大霉素、頭孢他啶、多粘菌素B高度敏感；對氧氟沙星、新霉素、頭孢哌酮、紅霉素中度敏感；對青霉素、諾氟沙星、萬古霉素、卡那霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢唑啉、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、多西環素、四環素、苯唑西林、環丙沙星、頭孢拉定、哌拉西林具有耐藥性。結果詳見下表

3 討論

通過送檢單信息和電話聯系獲知，該長毛兔養殖場存欄1250 只，發病166 只，死亡67 只，發病率為13.28%，病死率為40.36%。最初發病時間在2018年9月28日，發病兔日齡在4月齡左右。在此期間，采用頭孢氨芐注射液、復方磺胺甲噁唑、甲砜霉素VB 治療，治療效果一般。由上述發病情況、治療情況，以及送檢臨床癥狀和病死兔剖檢情況，初步判斷該養殖場兔死亡的原因為疑似兔球蟲病和大腸桿菌病混合感染導致的死亡。

經試驗分析，根據兔糞便蟲卵檢查和分離的細菌在普通培養基和鑒別培養基上的生長形態、顏色、大小等和染色顯微鏡觀察結果，并結合細菌生化試驗和16S rRNA 測序結果表明，證實該其疫情是由兔球蟲和大腸桿菌混合感染引起。試驗中對分離株細菌進行了藥敏試驗，藥敏試驗表明：該分離株細菌對丁胺卡那霉素、呋喃唑酮、慶大霉素、頭孢他啶、多粘菌素B 高度敏感；對氧氟沙星、新霉素、頭孢哌酮、紅霉素中度敏感；對青霉素、諾氟沙星、復方新諾明、卡那霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢唑啉、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、多西環素、四環素、苯唑西林、環丙沙星、頭孢拉定、哌拉西林具有耐藥性。由此可鑒，養殖戶治療期間，所使用的抗生素頭孢氨芐注射液、復方磺胺甲噁唑都對此菌具有很強的耐藥性，所以導致治療效果一般。因此，在臨床應用上，防治兔球蟲病和大腸桿菌病混合感染的病例，應將抗球蟲藥物配和藥敏試驗敏感性藥物，交替輪換使用，避免產生耐藥性。

后期經反饋該兔專業養殖，社針對抗球蟲，配合抗生素治療，其治療效果極佳，暫無發病死亡兔。因此，對于兔球蟲和大腸桿菌病，應遵從預防為主，防治結合的原則，根據藥物敏感試驗確定治療方案，避免濫用抗生素導致生產耐藥性并影響食品安全。防控方面[6]：必須加強飼養管理,避免擁擠、受寒、受熱，提高抵抗力；嚴把飼草料和飲用水質量關；搞好兔舍及周圍環境衛生，及時清理糞便及其他污染物，保持兔舍的清潔、通風、干燥，并嚴格執行定期消毒制度，對兔舍、用具等進行全面消毒，并注意交替使用消毒藥。

表4 分離株兔大腸桿菌藥敏試驗結果統計表