利拉魯肽抑制ERS改善高脂飲食誘導的DN腎損害

梁日英?符暢?梁華?徐芬?王美君?蔡夢茵

【摘要】目的 探討內質網應激（ERS）機制是否參與調節利拉魯肽改善高脂飲食誘導的糖尿病腎病（DN）。方法 采用高脂飲食喂養7 ～8周齡C56BL/6小鼠共12周以誘導早期DN，正常飲食喂養小鼠作為對照組。將高脂飲食小鼠分為高脂飲食（HFD）組及高脂飲食+利拉魯肽干預（HFD+Lira）組，HFD+Lira組予腹腔注射利拉魯肽400 μg/（kg·d）8周。HFD組與對照組均予相對應體積的生理鹽水。每2周監測小鼠體質量及血糖情況，干預8周后評估/觀察小鼠胰島功能、胰島素抵抗、尿蛋白、腎臟組織形態結構以及腎臟組織ERS通路蛋白葡萄糖調節蛋白78（GRP78）與剪接型X-盒結合蛋白1（XBP1s）的表達水平。結果 HFD組體質量、空腹血糖和體脂含量均高于對照組;利拉魯肽干預8周后，與HFD組比較，HFD+Lira組體質量、空腹血糖和體脂含量均改善（P均< 0.01）。HFD組血糖、尿蛋白高于對照組、胰島素抵抗較對照組明顯，HFD+Lira組血糖及尿蛋白均低于HFD組、胰島素抵抗較HFD組改善（P均< 0.017）。對照組腎小球、腎小管結構正常，HFD組可見腎小管區域大量空泡形成、腎小球囊腔擴大、大量脂質沉積，與HFD組相比，HFD+Lira組腎小管區域空泡減少、擴大的腎小球囊腔及脂質沉積腔改善。HFD組GRP78與XBP1s蛋白表達水平均較對照組高，HFD+Lira組XBP1s蛋白的表達水平低于HFD組（P均< 0.017）。結論 利拉魯肽可能通過抑制ERS通路而改善高脂飲食喂養誘導的DN腎損害。

【關鍵詞】糖尿病腎病;胰高血糖素樣肽1;內質網應激;葡萄糖調節蛋白78;

剪接型X-盒結合蛋白1;利拉魯肽

Liraglutide alleviates high-fat diet-induced diabetic nephropathy by inhibiting endoplasmic reticulum stress Liang Riying， Fu Chang， Liang Hua， Xu Fen， Wang Meijun， Cai Mengyin. Department of Endocrin-ology and Metabolism， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Cai Mengyin， E-mail： my. sabrina. c@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate whether the mechanism of endoplasmic reticulum stress （ERS） is involved in the protective effect of liraglutide on diabetic nephropathy （DN） induced by high-fat diet.? Methods The 7-8-week old C56BL/6 mice were subjected to a high fat diet （HFD） for 12 weeks to establish mouse models with early DN， and those mice given with normal diet were allocated into the control group. Then， mice in the HFD group were further divided into the HFD and HFD+Liraglutide （HFD+Lira） groups. Mice in the HFD+Lira group were given with liraglutide at a dose of 400 μg/（kg·d） by intraperitoneal injection for 8 weeks. An equivalent amount of normal saline was administered in the HFD and control groups. During the period of animal experiment， body weight and fasting blood glucose were monitored every two weeks. At 8 weeks after intervention， the islet function， insulin resistance， urinary albumin， renal morphology and the expression levels of glucose regulatory protein 78 （GRP78） and X-box binding protein 1 splicing （XBP1s）? on the ERS signaling pathway in the renal tissues were evaluated or observed.? Results The body weight， fasting blood glucose and body fat content in the HFD group were significantly higher compared with those in the control group. At 8 weeks after liraglutide intervention， body weight， fasting blood glucose and body fat content in the HFD+Lira group were significantly alleviated than those in the HFD group （all P < 0.01）. In the HFD group， the fasting blood glucose and urinary albumin were higher， whereas the insulin resistance was more evident compared with those in the control group. In the HFD+Lira group， the fasting blood glucose and urinary albumin were significantly lower， whereas the insulin resistance was ameliorated compared with those in the HFD group （all P < 0.017）. The structures of glomerulus and renal tubules were normal in the control group. A large quantity of vacuoles in the renal tubule， Bowmans capsule space and a large amount of lipid deposition were observed in the HFD group. Compared with the HFD group， the amount of vacuoles in the renal tubule was reduced， and Bowmans capsule space and lipid deposition were alleviated. In the HFD group， the expression levels of GRP78 and XBP1s were significantly up-regulated compared with those in the control group （both P < 0.017）. The expression level of XBP1s in the HFD+Lira group was remarkably down-regulated than that in the HFD group （P < 0.017）.? Conclusion Liraglutide can mitigate DN injury induced by high-fat diet probably by suppressing the ERS signaling pathway.

【Key words】Diabetic nephropathy;Glucagon-like peptide 1;Endoplasmic reticulum stress;

Glucose regulatory protein 78;X-box binding protein 1 splicing;Liraglutide

約30% ～ 40%的1型糖尿病和2型糖尿病（T2DM）最終會發展為糖尿病腎病（DN）[1]。DN的發病機制主要涉及糖脂代謝紊亂、血流動力學的不穩定和炎癥通路等[2]。利拉魯肽屬于胰高血糖素樣肽1（GLP-1）受體激動劑，是治療T2DM的藥物之一。利拉魯肽的心血管結局（LEADER）研究顯示標準治療方案聯合利拉魯肽治療組患者相較標準治療方案組患者腎臟獲益效應更明顯，表現在腎臟不良事件包括新發大量蛋白尿、血清肌酐倍增、終末期腎病導致的死亡風險降低22%[3]。臨床常用的治療措施對防治DN仍遠遠不夠。LEADER研究結果為DN的治療帶來了新希望。研究表明，利拉魯肽有助于改善肥胖T2DM患者代謝指標，進一步探討GLP-1腎臟保護作用的分子機制有重要的臨床意義[4]。

內質網應激（ERS）是指細胞受到內外因素的刺激時，大量未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網聚積，若ERS持續不緩解將導致內質網功能受損，進而發生細胞凋亡;肌醇蛋白1（IRE1）、內質網激酶（PERK）和活化轉錄因子6（ATF6）是內質網膜上的應激信號感受蛋白[5]。高糖及高脂毒性可引發過度的ERS，促進糖尿病及其并發癥的發生與發展[6-7]。在患DN的人類及小鼠的腎臟組織標本中均可見過度的ERS[8-9]。X-盒結合蛋白1（XBP1） 是IRE1下游關鍵的轉錄調節因子，剪接型XBP1（XBP1s）是XBP1的活化形式。研究表明，XBP1s在調節糖脂代謝穩態中有重要的調控作用[10-11]。當內質網中未折疊蛋白含量增加且超過正常范圍時，葡萄糖調節蛋白78 （GRP78）與內質網膜上的IRE1、PERK和ATF6感受蛋白結合，使GRP78 表達上調，此外，GRP78 作為ERS標志蛋白，可與ERS激活的促凋亡受體結合，抑制其信號表達，從而維持機體內環境穩態[12-13]。因此，GRP78與XBP1s常被視為ERS的標志性蛋白。本課題組初步探討了ERS在利拉魯肽改善高脂飲食誘導DN腎損害中的作用。

材料與方法

一、材 料

7 ～ 8周齡的C56BL/6小鼠18只，購自南京大學模式動物研究所，無特定病原體（SPF）級，體質量為19 ～ 22 g。小鼠飼養于中山大學附屬第三醫院實驗動物中心屏障系統中。飼養環境為12 h人工日光燈照射、12 h黑夜，環境溫度（21±2）℃，小鼠自由進食和飲水。對照飼料購自廣東省實驗動物中心，高脂飼料購自美國Research Diets公司。胰島素注射液和利拉魯肽注射液均購自丹麥諾和諾德制藥有限公司。鼠尿蛋白ALBUWELL檢測試劑盒購自美國EXOCLL公司。蛋白酶抑制劑、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。GRP78和XBP1s抗體購自美國CST公司;紅外熒光染料標記兔二抗購自美國LI-COR公司。本實驗經中山大學附屬第三醫院實驗動物倫理委員會批準（批準號IACUC-F3-17-0801）。

二、方 法

1. 模型制備及標本采集

小鼠適應性喂養1周后，根據體質量分為正常飲食組（對照組，n = 5）及高脂飲食組（n = 13），分別給予正常對照飼料（脂肪供能占熱卡百分比為11%）及高脂飼料（脂肪供能占熱卡百分比為60%）飲食喂養誘導。喂養12周后再次根據體質量將高脂飲食組小鼠分為單純高脂飲食組（HFD組，n = 7），高脂飲食+利拉魯肽干預組（HFD+Lira組，n = 6）。HFD+Lira組小鼠給予利拉魯肽注射液400 μg/（kg·d）腹腔注射，對照組與HFD組小鼠按照體質量給予相對應體積的生理鹽水作為對照，3組均連續腹腔注射給藥或生理鹽水8周。

2. 指標檢測及標本采集

利拉魯肽腹腔注射8周后，收集小鼠24 h尿液;行腹腔內注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT）和腹腔內注射胰島素耐量試驗（IPITT）;使用動物體脂定量分析儀測量每只小鼠體內總脂肪重量和總肌肉重量以計算體脂含量;每2周檢測小鼠體質量及血糖。小鼠禁食8 h后麻醉處死，留取小鼠腎臟標本，固定于4%的多聚甲醛后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下進行觀察和拍照;制成冰凍切片后進行油紅O染色、75%乙醇分化、蘇木素復染后，用甘油明膠封片，在光學顯微鏡下進行觀察和拍照。

3. 酶聯免疫吸附法測定鼠尿蛋白

設置標準曲線和陰性、陽性對照孔，歷經孵育抗體、洗滌、顯色等實驗步驟后，設置酶標儀的測量波長為450 nm，測量出每個樣本的光密度（OD值）。將蛋白標準品的光OD值輸入ELISA Calc軟件，做出鼠尿蛋白標準曲線。根據軟件得出的標準曲線，計算每個尿樣品稀釋之后的蛋白濃度。

4. 用蛋白免疫印跡法檢測小鼠腎組織ERS通路相關蛋白GRP78及XBP1s的表達

剪取腎臟組織15 mg于100 μl預冷的含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取腎臟總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經過電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉、孵育一抗、外熒光染料標記二抗、Odyssey雙色紅外激光成像系統曝光蛋白條帶后，使用Image-Pro Plus 軟件進行灰度分析，用目的蛋白灰度值/內參灰度值表示目的蛋白相對表達水平。

三、統計學處理

采用SPSS 22.0處理數據，正態分布的計量資料以表示，多組定量資料比較用單因素方差分析。α= 0.05，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗水準，即P < 0.017為差異有統計學意義。

結果

一、利拉魯肽改善高脂飲食誘導所致C57BL/6小鼠體質量增加和空腹血糖受損情況

高脂誘導20周后，與對照組相比，HFD組小鼠體質量、空腹血糖和體脂含量升高（P均< 0.017）;給予干預8周后，HFD+Lira組小鼠體質量、空腹血糖和體脂含量較HFD組改善（P均< 0.01），見表1。

二、利拉魯肽改善高脂飲食誘導所致C57BL/6小鼠糖耐量受損和胰島素抵抗

IPGTT結果表明，腹腔注射葡萄糖后，3組小鼠的IPGTT結果曲線下面積比較差異有統計學意義（F = 25.523，P < 0.001）。與對照組相比，HFD組小鼠0、30、60、90、120 min時的血糖明顯升高，曲線下面積增加[（2491.93±130.46）mm2 vs. （1290.30±94.10）mm2，P < 0.001）]，提示HFD組小鼠葡萄糖耐量受損。給予干預8周后，與HFD組相比，HFD+Lira組30、60、90、120 min時的血糖下降，曲線下面積減少[（1332.00±43.95）mm2 vs.（2491.93±130.46）mm2，P < 0.001）]，提示給予利拉魯肽干預后高脂飲食誘導所致的葡萄糖耐量受損明顯改善，見圖1A。

IPITT結果表明，腹腔注射胰島素后，3組小鼠的IPITT結果曲線下面積比較差異有統計學意義（F = 8.186，P = 0.004）。與對照組相比，HFD組小鼠60、90、120 min時的血糖相對0 min時的血糖下降的幅度更大，曲線下面積增加[（86.80±3.22）mm2 vs.（67.62±4.85）mm2，P = 0.009）]，提示HFD組小鼠胰島素抵抗明顯;給予干預8周后，與HFD組相比，HFD+Lira組90、120 min時的血糖相對0 min時的血糖下降幅度小，曲線下面積減少[（71.79±3.55）mm2 vs.（86.80±3.22）mm2，P = 0.013）]，提示給予利拉魯肽干預后由高脂飲食誘導的胰島素抵抗明顯改善，見圖1B。

三、利拉魯肽改善高脂飲食喂養的C57BL/6小鼠尿蛋白

高脂飲食誘導20周后，HFD組小鼠尿蛋白水平較對照組高[（5.13±0.65）μg/ml vs. （2.47±0.35）μg/ml，P = 0.010];給予干預8周后，3組小鼠的尿蛋白比較差異有統計學意義（F = 9.579，P = 0.003），HFD+Lira組小鼠尿蛋白水平較HFD組低[（2.29±0.22）μg/m vs. （5.13±0.65）μg/ml，P = 0.006]，見圖2。

四、利拉魯肽改善高脂飲食喂養的C57BL/6小鼠腎損害

腎臟組織HE染色結果顯示，對照組小鼠腎小球、腎小管結構正常;HFD組腎小管區域大量空泡形成，腎小球囊腔擴大;與HFD組相比，HFD+Lira組腎小管區域空泡減少，擴大的腎小球囊腔得以改善。腎臟組織油紅O染色結果顯示，與對照組相比，HFD組小鼠腎小管、腎小球區域大量脂質沉積;HFD+Lira組小鼠腎小管、腎小球區域的脂質沉積較HFD組改善，見圖3。

五、利拉魯肽對高脂喂養的C57BL/6小鼠腎臟組織ERS通路的影響

蛋白免疫印跡結果顯示，給予干預8周后，3組小鼠腎臟組織的GRP78蛋白表達水平比較差異有統計學意義（F = 9.297，P = 0.008），HFD組GRP78蛋白表達水平較對照組高（2.14±0.24 vs. 1.00±0.099，P = 0.011），見圖4A。給予干預8周后，3組小鼠腎臟組織的XBP1s蛋白表達水平比較差異有統計學意義（F = 10.452，P = 0.002），HFD組XBP1s蛋白表達水平較對照組高（2.173±0.252 vs. 1.000±0.254，P = 0.009），HFD+Lira組XBP1s表達水平較HFD組低（1.176 ±0.092 vs. 2.173±0.252，P = 0.003），見圖4B。

討論

DN是糖尿病常見的并發癥，其病理過程主要包括由足細胞損傷等引起的微量蛋白尿，腎小球系膜擴張及腎小球和腎小管肥大增生，進一步進展為腎小球硬化和腎臟組織纖維化[1]。目前的降糖、降壓、ACEI/ARB等DN治療方案雖能降低尿蛋白與尿肌酐比值，但仍遠遠不夠。LEADER研究顯示利拉魯肽除了降低體質量、改善糖脂代謝外，還有獨立于降血糖效應的顯著腎臟保護作用，但利拉魯肽改善DN的具體分子機制仍未清楚。研究表明，DN動物模型表現出尿蛋白升高和腎臟組織病理結構改變，比如系膜擴張、K-W結節等，高脂喂養的C56BL/6小鼠表現出DN的早期表現，即尿蛋白升高[14]。本課題組通過高脂飲食喂養C57BL/6小鼠模擬T2DM早期DN模型，再給予利拉魯肽腹腔注射治療，進而探討利拉魯肽改善DN的分子機制。本研究結果表明，高脂飲食喂養后，C56BL/6小鼠體質量增加、空腹血糖升高、腹腔內注射葡萄糖耐量受損和腹腔內注射胰島素抵抗明顯;尿蛋白明顯升高、腎小管區域大量空泡形成，腎小球囊腔擴大，腎臟組織脂質沉積等，表明我們在C57BL/6小鼠上成功構建了早期DN模型。我們發現利拉魯肽在調節血糖穩態和保護腎臟方面有獨特作用，利拉魯肽降低了高脂喂養C56BL/6小鼠的體質量、空腹血糖，改善了腹腔內注射葡萄糖耐量和腹腔內注射胰島素耐量，降低了尿蛋白，改善腎臟組織的脂質沉積、減少腎小管區域的空泡和改善增大的腎小球囊腔。

既往研究顯示DN患者和小鼠腎組織中ERS標志蛋白GRP78、XBP1s等的表達增加，DN中存在ERS，ERS參與了DN的發生發展，ERS相關的細胞凋亡和腎臟損傷是導致DN的原因之一[8]。ERS對于DN而言是雙刃劍，早期的高血糖和蛋白尿，ERS作為一種適應性反應對腎小管上皮細胞起保護作用，但持續的高血糖和蛋白尿最終會導致腎小管上皮細胞凋亡[8]。此外，ERS還介導了足細胞損傷，參與了腎小球系膜細胞損傷及細胞外基質增生等。Hotamisligil等（2010年）的研究表明GLP-1可以通過抑制ERS在糖脂代謝疾病中發揮重要調節作用。Yusta等（2006年）提出GLP-1受體激動劑Exendin-4通過抑制胰島β細胞的ERS通路進而改善糖尿病小鼠胰島β細胞的功能和抑制胰島β細胞的凋亡。Zheng等（2017年）的研究表明Exenatide干預能逆轉高脂毒性所致的C57BL/6小鼠和改善棕櫚酸誘導的肝臟HepG2細胞的ERS，進而發揮保護肝臟功能的作用。利拉魯肽能保護肥胖和胰島素抵抗小鼠模型的脂肪細胞免受ERS的損害。以上均提示，GLP-1受體激動劑改善糖尿病患者腎功能可能與改善過度激活的ERS有關。本研究顯示，利拉魯肽能抑制高脂飲食喂養C57BL/6小鼠腎臟組織ERS通路的激活。因此，利拉魯肽可能通過抑制ERS通路進而改善高脂飲食喂養所致的DN腎損害。但是，本研究尚未能闡述利拉魯肽是如何介導改善腎臟組織ERS進而改善DN的結局，此疑問還有待進一步開展轉基因小鼠實驗、體外細胞實驗等以進一步探討相關的分子機制。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-08-30）

（本文編輯：洪悅民）