分泌性中耳炎患者耳積液中miR-146a和miR-155的表達研究 ???

王慶亮 徐錦

【摘要】目的 探討分泌性中耳炎（SOM）患者耳積液中微小核糖核酸-146a（miR-146a）和miR-155的表達及臨床意義。方法 58例SOM患者作為研究對象（SOM組），另選取30名體檢健康者作為對照組。應用實時熒光定量PCR法檢測2組血漿及SOM組耳積液miR-146a和miR-155表達情況，應用ELISA檢測2組血漿及SOM組耳積液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平，并對miR-146a、miR-155與輔助性T淋巴細胞1（Th1）、Th2細胞比例以及Th1/Th2進行相關性分析。結果 與對照組相比，SOM組血漿、耳積液中miR-146a、miR-155、CD4+ Th1、CD4+ Th2、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高（P均< 0.05）;與SOM組血漿值相比，SOM組耳積液中miR-146a、miR-155、CD4+ Th1、CD4+ Th2、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4表達水平均升高（P均< 0.05）;Pearson相關分析顯示：SOM組患者耳積液miR-146a、miR-155水平與CD4+ Th1細胞比例、CD4+ Th2細胞比例、Th1/Th2均呈正相關，耳積液miR-146a、miR-155表達與IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10呈正相關。結論 SOM患者耳積液中miR-146a和miR-155高表達，miR-146a、miR-155可能通過影響Th1/Th2平衡而促進炎癥進展。

【關鍵詞】 分泌性中耳炎;微小核糖核酸-146a;微小核糖核酸-155;耳積液

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of microRNA-146a （miR-146a） and microRNA-155 （miR-155） in the ear effusion of patients with secretory otitis media （SOM）.? Methods A total of 58 SOM patients were assigned into the SOM group， and 30 healthy subjects were recruited into the control group. The expression levels of miR-146a and miR-155 in the plasma between two groups and in the auricular effusion in the SOM group were quantitatively measured by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression levels of interleukin-2 （IL-2）， interferon-γ（IFN-γ）， interleukin-4 （IL-4） and interleukin-10 （IL-10） in the plasma between two groups and in the auricular effusion in the SOM group were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The correlation between miR-146a， miR-155， Th1 and Th2 proportion and Th1/Th2 was analyzed.? ResultsCompared with the control group， the expression levels of miR-146a， miR-155， CD4+ Th1， CD4+ Th1， Th1/Th2， IL-2， IFN-γ， IL-4， IL-10， IFN-γ/IL-4 were significantly up-regulated in the SOM group （all P < 0.05）. Compared with plasma expression of the SOM group， the expression levels of miR-146a， miR-155， CD4+ Th1， CD4+ Th2， Th1/Th2， IL-2， IFN-γ， IL-4， IL-10， IFN-γ/IL-4 in the auricular effusion were up-regulated （all P < 0.05）.Pearsons correlation analysis demonstrated that the expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated with the proportion of CD4+ Th1， CD4+ Th2 and Th1/Th2. The expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated with IL-2， IFN-γ， IL-4 and IL-10 in the auricular effusion.? Conclusions The miR-146a and miR-155 are highly expressed in the ear effusion of SOM patients. The miR-146a and miR-155 can promote the progression of inflammation probably by affecting the balance of Th1/Th2.

【Key words】Secretory otitis media;Micro RNA-146a;Micro RNA-155;Ear effusion

分泌性中耳炎（SOM）是耳鼻喉科常見疾病之一，以中耳積液及聽力下降為主要特征，可造成患者聽力損傷，影響語言發展，甚至永久性失聰[1-2]。由于耳痛不明顯，至聽力受影響才就診，多延誤最佳治療時機。有研究表明，輔助性T淋巴細胞1（Th1）/Th2失衡可能是引起SOM的原因之一[3]。而微小RNA-146a（miR-146a）、miR-155已被證實在某些免疫性炎癥疾病或炎性環境中過表達，但miR-146a、miR-155在分泌性中耳炎中表達以及與Th1/Th2平衡的關系研究者較少[4-5]。本研究主要比較SOM患者血漿、耳積液與健康者血漿中miR-146a、miR-155水平，并分析miR-146a、miR-155與Th1/Th2相關性，為SOM發病機制提供理論依據。

對象與方法

一、研究對象

選取2016年9月至2018年9月于本院耳鼻喉科就診的SOM患者58例作為研究對象，其中男27例、女31例，年齡（36.28±4.39）歲;單耳積液33例，雙耳積液25例;黏液性28例，漿液性30例。納入標準：有明顯聽力減退者;發病時間≥21 d;經臨床檢查、鼓氣耳鏡檢查、聲導抗測試、電測聽及診斷性鼓膜穿刺確診SOM。排除標準：合并鼻咽部腫瘤、鼻咽癌或鼻咽部占位性病變等;合并全身系統系疾病;中途退出研究者。另選取同時期體檢健康者30名，排除SOM病史，經體檢者同意收集血漿標本作為對照。其中男13例、女17例，年齡（36.37±4.42）歲。本研究經醫院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

二、方 法

1.樣本收集

血漿標本：所有研究對象于晨起空腹抽取肘靜脈血5 ml置于裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管中，平均分成2份，1份3 000轉/分 -4℃離心20 min，取上清置于-80℃冰箱保存，現用現融，另1份直接置于-80℃冰箱保存。

耳積液標本：SOM患者外耳道經常規消毒，鼓膜表面麻醉，無菌條件下于鼓膜前下象限穿刺抽取耳積液0.1 ml，封口標記，置于-80℃冰箱保存，以供后續使用。

2.實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血漿、耳積液中miR-146a和miR-155表達

采用qRT-PCR法測定對照組血漿、SOM組血漿、耳積液中miR-146a和miR-155表達情況。取上述血漿、耳積液樣本，按照Trizol LS（賽默飛世爾科技）試劑盒說明書操作提取血清總RNA，按照Bio Rad逆轉錄試劑盒（賽默飛世爾科技）操作步驟將2 μgRNA逆轉錄為cDNA，之后按照SYBR Green PCR master mix試劑說明配反應體系并加樣。qRT-PCR反應體系共為20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，雙蒸水 6.0 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進行反應，程序設定為：95℃預熱1 min，95℃ 15 s，

60℃ 30 s，72℃ 15 s，以上三步驟共循環40次。miR-146a和miR-155均以U6為內參基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設計見表1。反應結束后對Ct值進行數據分析，采用2-ΔΔCt法計算miR-146a和miR-155相對表達量。

3.流式細胞術檢測研究對象外周血CD4+細胞Th1、Th2細胞比例

取抗凝靜脈血，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，3 000轉/分離心30 min，上中層交界處為淋巴細胞、單核細胞混合液，3 000轉/分離心30 min，保留沉淀為單核細胞，均加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人CD4單克隆抗體20 μl，避光培育15 min，分別添加藻紅蛋白（PE）標記的IFN-γ抗體、IL-4抗體20 μl，避光培育30 min，離心后棄上清，置于流式細胞儀下檢測Th1、Th2細胞比例。上機前常規對流式細胞儀進行檢測，控制儀器各項指標在質控允許值內，每份檢測標本獲取設門內10 000個細胞，檢測后所得數據以Listmode文件形式保存。

4.細胞因子檢測

取血漿、耳積液標本置于冰上解凍，恢復室溫后采用ELISA試劑盒檢測其中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10水平，檢測試劑盒分別為人IL-2 ELISA試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司）、IFN-γELISA試劑盒（上海齊一生物科技有限公司）、人IL-4 ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）、人IL-10 ELISA試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）。嚴格參照試劑盒操作說明書進行操作。

三、統計學處理

采用SPSS 17.0進行數據分析，計量資料符合正態分布的均以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，通過Pearson法進行相關性分析，P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、SOM組和對照組miR-146a和miR-155水平比較

與對照組相比，SOM組血漿、耳積液中miR-146a、miR-155表達水平均升高（P均< 0.05）;與SOM組血漿中miR-146a、miR-155表達水平相比，耳積液中miR-146a、miR-155表達水平均升高（P均< 0.05），見表2。

二、SOM組和對照組CD4+細胞Th1、Th2細胞比例、Th1/Th2比較

與對照組相比，SOM組血漿、耳積液中CD4+ Th1比例、CD4+ Th2比例、Th1/Th2表達水平均升高（P均< 0.05）;與SOM組血漿標本相比，SOM組耳積液中CD4+ Th1比例、CD4+ Th2比例、Th1/Th2表達水平均升高（P均< 0.05），見表3。

三、SOM組和對照組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較

與對照組相比，SOM組血漿、耳積液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高（P均< 0.05）;與SOM組血漿標本相比，SOM組耳積液標本中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高（P均< 0.05），見表4。

四、SOM組耳積液miR-146a、miR-155與CD4+ Th1、CD4+ Th2細胞比例、Th1/Th2及細胞因子相關性分析

Pearson相關分析顯示，SOM患者耳積液中miR-146a、miR-155表達與CD4+ Th1細胞比例、CD4+ Th2細胞比例、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10均呈正相關（P均< 0.05），見表5。

討論

SOM主要表現為中耳積液及聽力下降，大部分患者可自愈，或經治療后好轉，但仍有10%左右患者發展為慢性中耳炎且反復發作，嚴重影響患者生存質量。目前關于SOM的病因及發病機制尚不完全清楚。有研究表明，咽鼓管功能障礙、感染、自身免疫疾病等均可造成SOM[7]。隨著免疫學的深入研究，Th1/Th2失衡在諸多炎性疾病中發揮作用[3]。微小核糖核酸是機體非編碼微小RNA，可通過調節靶基因mRNA的翻譯以及翻譯后轉錄調控靶基因的蛋白表達，在炎性疾病中發揮重要作用。有報道稱，miR-146a、miR-155參與炎癥反應，但miR-146a、miR-155在SOM中以及與Th1/Th2關系尚不清楚[4-5]。

miR-146a是由miR-146經加工后產生的，位于5q34[8]。研究表明，miR-146a可介導炎癥反應[9-11]。

本研究中，SOM患者血漿中miR-146a水平顯著高于健康對照者血漿中含量，提示miR-146a水平可能與SOM的發病密切相關，而SOM患者耳積液中miR-146a表達量又顯著高于患者血漿中含量，提示耳積液中miR-146a水平對SOM的發病更為敏感。miR-155是一個典型的多功能微小RNA，位于非編碼區基因BIC內，在免疫、炎癥的調控中發揮重要作用[12-13]。譚玉軍等[14]研究表明，miR-155在脂多糖誘導的RAW2647巨噬細胞炎癥反應中高表達，而巨噬細胞發揮促炎作用也是引起SOM的重要因素，據此猜測，miR-155可能在SOM患者耳積液中也有類似表達。本研究中，健康對照者血漿、SOM患者血漿、SOM患者耳積液中miR-155水平依次升高，提示miR-146a水平升高可能與SOM的發病密切相關，且SOM患者耳積液較血漿更能體現SOM病情嚴重程度。

Th細胞間的平衡狀態與多種疾病的發生發展密切相關[15]，Th1細胞主要介導細胞免疫應答，分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，促進細胞毒T細胞的殺傷作用，激活巨噬細胞殺滅細胞病原體[16]。Th2主要介導體液免疫，分泌IL-4、IL-10等細胞因子，抑制細胞免疫應答，使Th1、Th2處于免疫平衡狀態，集中力量清除外來抗原，是體內體液免疫及細胞免疫間重要的調節樞紐，Th1/Th2失衡則導致各種炎癥發生[17-18]。本研究中，SOM患者血漿、耳積液中CD4+ 細胞中Th1細胞比例、Th2細胞比例均顯著高于健康對照者血漿中含量，與Th1細胞相比，Th2細胞增長幅度較少，導致Th1/Th2升高。同時Th1相關細胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2相關細胞因子IL-4I、L-10水平顯著升高，提示SOM患者存在較為復雜的炎癥反應，促炎因子與抑炎因子均大量產生。此外，IFN-γ/IL-4顯著升高，提示SOM患者Th1/Th2失衡，呈Th1優勢。本研究進一步表明，SOM患者血漿、耳積液中miR-146a、miR-155與Th1細胞比例、Th2細胞比例、Th1/Th2以及細胞分泌因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10呈正相關，推測miR-146a、miR-155可能通過影響Th1/Th2平衡參與SOM發生發展進程，但miR-146a、miR-155如何影響Th1/Th2平衡機制還有待進一步研究。本研究也存在一定不足，因為Th1、Th2并沒有標志性的抗體，本研究用IFN-γ、IL-4分別代表Th1、Th2細胞比例，但IFN-γ、IL-4并非只由CD4+ 細胞產生，CD8+等T細胞亦可產生，只能代表一種趨勢。

綜上所述，SOM患者耳積液中miR-146a、miR-155高表達，可能通過影響Th1/Th2平衡參與SOM發病過程。

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（收稿日期：2019-03-18）

（本文編輯：楊江瑜）