微波提取-高壓液相色譜-原子熒光光譜聯用(HPLC-AFS)法分析稻米樣品中砷形態

魏洪敏 甄長偉 煉曉璐 李銀賀 柴 剛

(北京海光儀器有限公司,北京100015)

前言

元素的毒性與元素的存在形態息息相關，就砷元素而言，無機砷的毒性要大于有機砷[1-2]。因此，在分析砷元素時，其形態分析是十分必要的，比用砷的總量來評價更具科學性。近年來聯用技術已經成為元素形態分析的主要手段。高效液相色譜-原子熒光光譜聯用法可以對砷元素各形態進行有效分離，然后再逐一檢測，從而實現樣品的在線分離與測定。目前該方法已用于土壤[3]、大米[4]、水產動植物[5]、地下水[6]等樣品中砷元素的形態分析。

食品安全國家標準GB 5009.11—2014《食品中總砷和無機砷的測定》，應用的是液相色譜-原子熒光光譜聯用法[7]。本文圍繞該標準，使用液相色譜-原子熒光光譜聯用儀，對樣品前處理方法、流動相、氫化反應條件等進行了優化。并在最優條件下對稻米及稻米標準物質進行分析測定，也對方法的精密度、加標回收率、檢出限等指標進行了驗證，測定結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-AFS 6500液相-原子熒光聯用儀(北京海光儀器有限公司)、微波消解儀(上海新儀微波化學科技有限公司)、真空抽濾裝置(天津奧特賽斯儀器有限公司)、BGZ-76電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)、高性能空心陰極燈(北京有色金屬研究總院)、pH計、離心機等。

磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸(優級純，北京化工廠)、硝酸(優級純)、硼氫化鉀，除另有說明，所用試劑均為分析純，且購買于國藥集團化學試劑有限公司。

砷形態溶液標準物質購買于中國計量科學研究院：亞砷酸根[GBW08667，(75.7±1.2) μg/g]，二甲基砷酸[GBW08666，(52.9±1.8) μg/g]，甲基砷酸[GBW08669，(25.1±0.8) μg/g]，砷酸根[GBW08667，(17.5±0.4) μg/g]，含量均以As計。

1.2 樣品前處理

稱取約1.0 g樣品于微波消解罐中，加20 mL硝酸溶液(0.15 mol/L)，用微波消解儀90 ℃下恒溫提取50 min。提取完畢后冷卻至室溫，于8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，使用液相色譜-原子熒光光譜聯用儀進行測定。

1.3 分析條件

砷形態的測定條件如表1所示。

表1 砷形態測定條件

2 結果與討論

本文對影響測量的條件進行了優化，包括樣品前處理、流動相選擇、氫化物發生條件。

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 樣品前處理

形態分析的前處理一定要保證被測組分不能發生形態轉變。選取了某糙米樣品(含As(III)和DMA兩種目標組分)，使用稀硝酸進行提取，研究了熱浸提取和微波提取兩種方法。

熱浸提?。悍Q取約1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL硝酸溶液(0.15 mol/L)，放置過夜。于90 ℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每30 min振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫，于8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，使用液相色譜-原子熒光光譜聯用儀進行測定。

微波提取：按樣品處理方法處理樣品，分別提取了20、30、40、50、60 min，結果表明，50 min時，目標組分已基本提取完全。

兩種方法經過對比分析發現，微波提取與熱浸提取的測定結果相當，鑒于微波提取大大縮短了樣品前處理的時間，最終選用了微波提取，且提取時間為50 min。

2.1.2 流動相

2.1.2.1 流動相的選擇

不同的元素形態具有不同的理化性質和毒性，不同形態的砷化合物能夠被離子交換色譜分離的主要原因是：在適宜的pH值下，砷的化合物能夠在流動相中電離，以不同離子形態存在于水溶液中。通常，對流動相有如下要求：1)對被分析物具有合適的溶解度，并提供離子交換所必須的緩沖溶液；2)對被測離子有不同的洗脫能力，能從分離柱中依次取代這些離子；3)要有合適的離子強度，以控制各目標分析物的保留時間。離子交換色譜一般都以各種鹽類的緩沖溶液作流動相，通過調節緩沖溶液類型、pH值、離子強度，以及通過加少量有機溶劑等增加對被分析物的分離選擇性，使待測樣品達到良好的分離效果[8]。

使用Hamilton陰離子交換柱，以15 mmol/L磷酸二氫銨(pH=6)為流動相，分離測定砷元素的4個形態(As(III)、MMA、DMA和As(V))，分析時間約為15 min。為提高效率縮短分析時間，對流動相進行了調整。參照文獻[9]，選取了KH2PO4-Na2HPO4緩沖體系，并摸索了其對砷形態分離的影響。最終確定的流動相組成為KH2PO4(45 mmol/L)-Na2HPO4(5 mmol/L)，使用該流動相砷形態4個組分能夠在7 min內達到基線分離，分析時間遠遠低于國家標準“GB5009.17—2014”中給出參考的12 min。

2.1.2.2 流動相的配制

NH4H2PO4(15 mmol/L，pH=6)：稱取1.7g NH4H2PO4，溶于1 000 mL水中，用氨水調節pH值為6.0。

KH2PO4(45 mmol/L)-Na2HPO4(5 mmol/L)：稱取3.026 g KH2PO4和0.895 4 g Na2HPO4·12H2O，溶于500 mL水中，混勻，溶液的pH值為5.91，無需調節。

2.1.2.3 流動相的優化

按表2的比例配制流動相(pH值實測值與表中吻合)，分別使用上述流動相對砷形態標準溶液進行洗脫，LC-AFS的其余測定條件見表1。測定結果見圖1，從上至下對應流動相的pH值分別為：5.29、5.59、5.91、6.24、6.47、6.64、6.81、9.18，從圖中可知：1)隨著流動相pH值的增大，As(III)保留時間基本保持不變，As(V)的保留時間逐漸縮短；2)pH值為5.91時，各組分分離效果最好；3)pH值較低時，As(III)和DMA分離不好；4)pH值較高時，DMA和MMA分離不好，甚至兩色譜峰完全重疊。

表2 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液

為獲得更好的分離效果，在KH2PO4和Na2HPO4比例為9∶1的條件下，對流動相進行稀釋以降低離子強度。實驗了總濃度為50 mmol/L和25 mmol/L的流動相，其pH值均為5.91，并與表格中的1/15 mol/L(總濃度為66.7 mmol/L)的流動相進行對比分析，各組分的分離效果見圖2。從圖2可知，隨著流動相中鹽濃度的降低，各組分的分離效果變好，但某些組分的保留時間延長且峰展寬嚴重。綜合考慮選擇了50 mmol/L[KH2PO4(45 mmol/L)-Na2HPO4(5 mmol/L)]的緩沖鹽作為流動相。

圖1 流動相對砷形態分離效果的影響Figure 1 Effect of mobile phase on the separation efficiency of arsenic speciation

圖2 離子強度對分離效果的影響Figure 2 Effect of ionic strength on the separation efficiency of arsenic speciation.

2.1.3 氫化反應條件

2.1.3.1 載流

以鹽酸為載流，研究了其濃度對各形態峰面積的影響。從圖3可知，當載流濃度為2%時，峰面積較小，可能是由于酸濃度低時，反應速率低導致響應值低；載流濃度為5%時，峰面積最大。載流濃度大于10%時，各組分的峰面積逐漸降低，可能是由于反應過程中產生的大量氫氣稀釋了原子化器中砷元素的濃度。但當載流為10%時譜圖的基線更平穩。最終，選擇載流濃度為10%。

圖3 載流濃度對峰面積的影響Figure 3 Effect of concentration of carrier currenton the peak area.

2.1.3.2 還原劑

還原劑的作用是在一定的酸度下將砷元素各形態還原為氫化物。研究了KBH4溶液濃度對砷形態峰面積的影響。從圖4可知，當KBH4濃度為20 g/L和40 g/L時，各組分的峰面積相對較高?？紤]到40 g/L時“氫化反應”較劇烈，基線波動較大，最終選擇了20 g/L的KBH4作為還原劑。當KBH4濃度為10 g/L時，響應值都偏低，這可能是由于氫化反應效率較低；當KBH4濃度較高時，可能是由于反應過程中產生的大量氫氣稀釋了原子化器中砷原子的濃度，使得峰面積偏低。

圖4 還原劑濃度對峰面積的影響Figure 4 Effect of concentration of reducing agent on the peak area.

2.1.3.3 載氣

實驗研究了載氣流速對各組分峰面積的影響。從圖5可知，隨著載氣流速的增加，各組分的峰面積都逐漸降低，當載氣流速為200 mL/min時各組分的峰面積最大；在實驗中發現流速為200 mL/min時，會引起較大的基線噪聲和漂移。隨著流速的繼續增高，原子蒸汽被稀釋，峰面積值降低。最終，選取300 mL/min為載氣流速。

圖5 載氣流速對峰面積的影響Figure 5 Effect of speed of carrier gas on the peak area.

2.1.3.4 屏蔽氣

屏蔽氣能保持火焰形狀穩定。研究了屏蔽氣流速對各組分峰面積的影響。從圖6圖可知，屏蔽氣流速為900 mL/min時，4個組分的峰面積均最大。因此，選用900 mL/min為屏蔽氣流速。

圖6 屏蔽氣流速對峰面積的影響Figure 6 Effect of speed of shieldinggas on the peak area.

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍與檢出限

考察方法的線性范圍和檢出限(以3倍的基線噪聲比計)，結果見表3。配制一系列砷形態的標準樣品：濃度為2、4、6、8和10 ng/mL，繪制標準曲線，結果表明，各組分在測定范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.998 8。檢出限分別為0.29、0.47、0.62和1.16 ng/mL。

2.2.2 精密度實驗

對同一濃度的砷形態標準溶液連續進樣7次，將峰面積測定結果列于表4中，以峰面積RSD衡量定量重現性。從表4可知，峰面積RSD均低于3.1%，表明方法重現性較好。

表3 線性范圍與檢出限

表4 方法精密度實驗

2.3 實際樣品分析

按照實驗方法分析3個市售大米樣品以及2個糙米樣品，將分析結果匯總于表5中。從表5數據可知，在所測定的樣品中，As(III)都有檢出、DMA和As(V)部分檢出、MMA均為未檢出，且所有樣品中總無機砷的含量均未超過“GB 2762—2012”中規定的限定值[10](該標準中稻谷、糙米、大米中總無機砷的限量為0.2 mg/kg)。

表5 樣品測定結果

另外，對稻米標準物質進行測定，該標準物質證書中總無機砷為(0.298±0.008) mg/kg，二甲基砷酸為(0.018 6±0.000 8) mg/kg。實際測定總無機砷的含量為0.297 mg/kg，DMA的含量為0.019 mg/kg，可見結果都在不確定度范圍內，說明該方法對無機砷的測定結果準確。

同時，對市售大米樣品和糙米樣品進行加標回收實驗，添加水平為2 ng/mL和4 ng/mL，并將加標回收結果列于表6和表7中。結果表明，4個組分在兩類樣品中的回收率都較好，回收率為85.1%～113%。

表6 市售大米1加標回收測定結果

2.4 方法比較

建立的微波提取法與GB 5009.11—2014的對比結果見表8。從該表8可知，本實驗所選擇的微波提取法，前處理時間短、分析速度快，使用的載流和還原劑濃度也較低。

表7 糙米樣品1加標回收測定結果

表8 方法比較

3 結論

對GB 5009.11—2014中的樣品前處理方法及砷形態測定的影響因素進行了優化研究。建立了更加高效環保的微波提取法，在最優條件下對稻米樣品進行了測定，通過方法學考察和加標回收等實驗，驗證了該方法的有效性。結果表明該方法的線性范圍、檢出限、精密度和加標回收率等指標均良好，說明改進的方法完全可以用于稻米中砷形態的測定。