脂氧素A4改善肺微血管內皮細胞炎癥損傷的體外實驗研究

陳云志，連澤來，余華軍，孔鴻儒，戴勝杰，黃超豪，孫洪偉

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學 藥學一班，浙江 溫州325035）

脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）是機體自身在炎癥后期產生的一種內源性脂質抗炎介質，能促進炎癥反應的及時消退，其最突出的優點是在炎癥的病理過程中發揮作用且不會干擾機體正常的生理活動，無糖皮質激素、非甾體抗炎藥和免疫抑制劑等傳統抗炎藥的多種副作用[1-2]。因此，LXA4代表著全新的“促進炎癥消退”的炎癥治療策略，可能有很好的臨床應用前景[3]。我們前期的動物實驗證實，LXA4對重癥急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）繼發的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）有治療作用，但其具體的作用機制尚不十分清楚。肺微血管內皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是肺的主要功能細胞，它介于血液和組織之間，在SAP繼發ALI的過程中發揮著至關重要的作用[4-5]。因此我們推測，LXA4對SAP繼發ALI的治療作用可能是通過改善PMVECs的炎癥損傷來實現的。本研究就LXA4對因炎癥受損的PMVECs是否有治療作用進行探討，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑材料

PMVECs（廣州Focusbio生物科技有限公司）；RPMI 1640（美國Gibco公司）；胰蛋白酶、DMSO、MTT（Sigma公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；LXA4（美國Cayman公司）；TNF-α（英國PEPROTECH公司）；ReverTra Ace? qPCR RT Kit、SYBR? Green Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）；GAPDH、IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65引物序列（上海Invitrogen生物有限公司）。

1.2 主要儀器

5% CO2恒溫培養箱；細胞超凈工作臺；倒置相差顯微鏡；7500型實時熒光定量PCR儀及分析軟件；

1.3 PMVECs的培養

用RPMI 1640培養基（含10% HyClone胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），在37 ℃、5%CO2條件下進行培養，瓶底被細胞鋪滿時，用0.25%胰酶消化，傳代培養。取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 分階段實驗及分組

第一階段：分為空白對照組（完全培養基培養）和TNF-α組（分別以5、10、20 ng/mL處理24 h），采用MTT法檢測空白對照組及不同濃度TNF-α組對PMVECs存活率及單層通透性的影響。第二階段：分為模型組（20 ng/mL TNF-α處理24 h）和治療組（1、10、100 μg/L LXA4干預24 h），檢測各項指標。

1.5 指標檢測

（1）PMVECs的鑒定及形態觀察：培養的PMVECs采用免疫熒光法檢測細胞CD31的表達，以此來鑒定不同組PMVECs在倒置顯微鏡下觀察生長情況及形態改變。（2）各組PMVECs細胞存活率檢測：采用MTT法。（3）各組PMVECs單層通透性的測定：用針頭式濾器檢測TNF-α損傷前后及LXA4干預后PMVECs單層通透性的變化。（4）各組PMVECs IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA的表達情況：細胞完成相應處理后，用Trizol提取各組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明分兩步完成逆轉錄反應：第一步，RNA在65 ℃進行5 min后，立即冰上冷卻；第二步，反應液組成：RT Enzyme Mix 0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，5×RT Buffer 2 μL，Nuclease-free Water 6 μL，RNA 1 μL；反應條件：37 ℃、15 min逆轉錄反應→98 ℃、5 min酶失活反應；進行實時熒光定量PCR（引物設計和合成由上海Invitrogen生物有限公司完成，具體見表1）。

表1 基因引物序列

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 PMVECs干預前后形態對比

首先通過免疫熒光CD31鑒定PMVECs，正常內皮細胞單層呈“鋪路石樣”外觀，CD31抗體免疫熒光染色后呈強陽性（如圖1A所示）。空白對照組細胞生長狀態良好，貼壁牢固，細胞間連接緊密，多角形或長條梭形，大小均勻，邊界清楚，呈單層“鋪路石”樣生長排列（如圖1B所示）。TNF-α處理后，細胞收縮、變圓，胞體變小，細胞間隙增寬，胞核模糊，細胞邊界變模糊，有細胞脫落的現象（如圖1C所示）。而LXA4干預后，與TNF-α處理組比較，細胞收縮情況有所好轉，呈短或長梭形改變，細胞邊界有向正常組變化的趨勢，細胞間緊密，細胞脫落較少（如圖1D所示）。

圖1 PMVECs干預前后形態對比

2.2 PMVECs經TNF-α干預前后細胞存活率的改變

經不同濃度TNF-α干預后，PMVECs存活率明顯下降，且該副效應隨TNF-α濃度遞增逐漸加強，如表2所示。

表2 不同濃度TNF-α干預PMVECs前后細胞存活率的改變（±s，n=6）

表2 不同濃度TNF-α干預PMVECs前后細胞存活率的改變（±s，n=6）

與空白對照組比較，**P＜0.01

分組 存活率（%） P值空白對照組 100±5.42 -5 ng/mL TNF-α組 76.39±9.30** 0.0003 10 ng/mL TNF-α組 61.87±11.67** ＜0.0001 20 ng/mL TNF-α組 49.54±12.64** ＜0.0001

2.3 不同濃度LXA4對TNF-α干預后PMVECs存活率的影響

TNF-α干預后的PMVECs，經不同濃度LXA4處理，其存活率明顯改善，且該正效應隨著LXA4濃度的遞增逐漸加強，如表3所示。

2.4 TNF-α對PMVECs單層通透性的影響及LXA4處理后的改善作用

表3 LXA4對炎癥損傷的PMVECs存活率的影響（±s，n=6）

表3 LXA4對炎癥損傷的PMVECs存活率的影響（±s，n=6）

與TNF-α組比較，**P＜0.01

組別 存活率（%） P值T N F-α組（2 0 n g/m L，下同） 5 0.7 3±1 4.4 3 -T N F-α+1 μ g/L L X A 4組 6 1.2 8±1 6.6 6 0.2 6 8 4 T N F-α+1 0 μ g/L L X A 4組 6 9.8 1±1 5.3 3 0.0 5 0 3 T N F-α+1 0 0 μ g/L L X A 4組 8 2.3 2±8.7 1** 0.0 0 1 0

TNF-α損傷30、60、90 min后PMVECs單層通透系數（Kf值）較損傷前顯著增高；加入LXA4干預時Kf值均顯著低于TNF-α組。測定結果如表4所示。

2.5 LXA4對損傷后PMVECs炎癥因子表達的影響

我們通過熒光定量RT-PCR分別檢測空白對照組、模型組及治療組（100 μg/L LXA4干預）的炎癥因子IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65的mRNA表達情況（采用2-△△CT方法進行計算）。結果顯示，TNF-α處理后，損傷的PMVECs炎癥因子IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65的mRNA表達明顯增加（P＜0.05）。而經LXA4干預后，IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65的mRNA表達明顯減少（P＜0.05），基本恢復到TNF-α干預前的水平（P＞0.05），如表5所示。

表4 TNF-α及LXA4對PMVECs通透系數的影響（±s，n=3）

表4 TNF-α及LXA4對PMVECs通透系數的影響（±s，n=3）

與損傷前比較用*P表示，與TNF-α組比較用#P表示

Kf（mL/min·cm2·kPa）損傷前 損傷后15 min 損傷后30 min 損傷后60 min 損傷后90 min TNF-α組 0.021±0.011 0.019±0.015 0.037±0.005 0.067±0.007 0.096±0.007*P值 - 0.8613 0.0835 0.0036 0.0006 TNF-α+LXA4組 0.019±0.010 0.020±0.008 0.029±0.009 0.039±0.008 0.058±0.011*P值 - 0.8989 0.2674 0.0538 0.0105#P值 0.8272 0.9238 0.2496 0.0103 0.0072組別

表5 三組炎癥因子的熒光定量RT-PCR結果（±s，n=3）

表5 三組炎癥因子的熒光定量RT-PCR結果（±s，n=3）

與對照組比較用*P表示，與模型組比較用#P表示

組別 m R N A相對表達量I L-1 β V C A M-1 N F-κ B p 6 5對照組 1.0 3±0.2 2 1.1 0±0.2 3 1.0 7±0.0 9模型組 5.8 9±0.1 4 2.4 6±0.5 4 3.8 3±0.3 2*P值 ＜0.0 0 0 1 0.0 1 6 0 0.0 0 0 1治療組 1.1 2±0.1 2 1.1 4±0.1 9 1.1 5±0.1 1*P值 0.5 6 7 6 0.8 2 7 8 0.3 8 4 8#P值 ＜0.0 0 0 1 0.0 1 6 2 0.0 0 0 2

3 討論

介于血液和組織間隙之間的PMVECs對調節肺的氣體交換及血液與肺間質之間的水液平衡至關重要[6]。炎癥介質導致PMVECs形態與功能受損，誘導PMVECs凋亡，由此引發PMVECs的連接由正常的緊密變為病態的疏松，最終使PMVECs屏障功能受損，毛細血管通透性增加，從而使得血管中的蛋白質及體液向肺間質的滲出增加，繼而導致ALI的發生[7-8]。TNF-α是炎癥介質的典型代表，是一種主要由活化的單核巨噬細胞產生的糖蛋白，是炎癥損傷級聯反應的觸發劑，在SAP繼發的ALI發生發展中起著關鍵作用[9]。

本研究體外培養人PMVECs，鏡下觀察到正常細胞生長狀態良好，呈大小均勻地多角形或長條梭形，貼壁牢固，細胞間連接緊密，呈單層“鋪路石”樣生長排列，與國內外研究報道一致[10-11]。而采用不同濃度（5、10、20 ng/mL）TNF-α干預PMVECs后，鏡下觀察PMVECs細胞收縮，胞體變小，形態變圓，細胞邊界模糊，間隙增寬，胞核模糊，有細胞脫落現象。與空白對照組PMVECs相比，TNF-α干預后的PMVECs存活率顯著降低，且隨著TNF-α濃度的升高，PMVECs的存活率明顯降低，單層通透性明顯升高。TNF-α干預后的PMVECs IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA表達量均顯著升高。上述結果均證明，TNF-α確能引起PMVECs的ALI。TNF-α主要通過作用于血管內皮細胞表面的TNF-α受體，使PMVECs產生IL-1β和IL-6等，共同介導病變血管的炎癥反應[9，12]。TNF-α與其受體結合后主要通過影響細胞內調控炎癥反應的關鍵因子（如NF-κB）的活化來調控炎癥反應，可激活中性粒細胞增加其表達白細胞分化抗原CD11+/CD18+復合物，同時激活血管內皮細胞（EC），使其表達ICAM-1與血管細胞黏附分子-1（VCAM-1），從而導致白細胞和EC間相互作用，促使釋放大量活性氧和彈性蛋白酶，損害血管內皮細胞和器官組織細胞，增加血管通透性[6，13-14]。

LXA4是機體自身在急性炎癥后期產生的一類脂質抗炎介質，具有廣泛的抗炎促消退功能，被譽為炎癥反應的“剎車信號”或“停止信號”。本研究結果顯示，LXA4干預組與TNF-α處理組比較，其PMVECs細胞收縮情況有所好轉，細胞間緊密，細胞脫落較少，細胞邊界有向正常組變化的趨勢；且PMVECs存活率和單層通透性均顯著改善，該效應具有劑量依賴性；PMVECs的炎癥因子IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA表達量均顯著下降。因此，我們的研究結果證實，LXA4確能改善TNF-α引起的PMVECs急性炎癥損傷。但LXA4通過何種分子途經達到上述治療作用，本研究尚未明確，我們推測可能與TNF-α的炎癥通路和凋亡通路相關，有待后續進一步深入研究。