乳酸鹽對冷卻肉護色機理的研究進展

邰晶晶，張玉斌*，吳仕達，李丙子，韓鋆，黃國業，余群力

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(榆中興業種養殖公司，甘肅 蘭州，730070)

冷卻肉銷售期間，在無法感受其質地和氣味的情況下，鮮肉具有的健康色澤成為消費者評價其品質的重要參考[1]。通常表面變色的鮮肉會切除表面加工成低價值的產品或以折扣價格出售，據美國肉類產業估計美國市場每年由于肉品變色造成的經濟損失高達 10 億美元，而由于肉品變色引起的肉類浪費對農業可持續性和環境的影響尚未確定[2-3]。因此，減少肉色劣變是肉類行業急需解決的問題。

乳酸鹽在 2000 年被美國農業部規定為“一般認為安全”(generally recognized as safe，GRAS)的添加劑，在早期肉制品加工業中，乳酸鈣、乳酸鉀、乳酸鈉3種不同陽離子的乳酸鹽主要發揮其防腐抑菌作用[4]。在抑制某些病原菌方面，按重量計乳酸鉀和乳酸鈉所允許的最大用量為4%[5]。陳景宜等[6]對背最長肌、腰大肌和半膜肌3個部位牛肉的肉色穩定性進行了研究，發現影響肌肉肉色穩定性的生化因素有很多種情況，其中高鐵肌紅蛋白還原酶活性、NADH濃度和乳酸脫氫酶與肉色穩定性有顯著的相關性。JOSEPH等[7]研究認為，從內在作用來看，向宰后肌肉中添加三羧酸循環中間代謝產物乳酸鹽，會誘導肌肉再生NADH，而NADH可以提高高鐵肌紅蛋白還原和改善肉色穩定性。最近十年已有大量的研究者報道乳酸鹽(注射增強)可影響肉色及其穩定性，但鮮見乳酸鹽對于肉色調控機理的總結性報告和綜述性文獻。基于此，本文綜述了乳酸鹽對冷卻肉的護色機理并概述相關研究進展，以期為冷卻肉的護色提供參考。

1 肉色

自 1932 年Theorell首次將肌肉色素進行結晶，他發現肌紅蛋白(myoglobin，Mb)不同于血紅蛋白(hemoglobin，Hb)[8]。除放血不當外，肉色并不是由血紅蛋白產生的，而是由肌紅蛋白決定的，肉表面的色澤不僅取決于肌紅蛋白的含量，還與肌紅蛋白分子的化學狀態、類型和其他成分的物理化學狀態有關[9]。

1.1 肌紅蛋白

肌紅蛋白是一種復合蛋白質，相對分子質量在 17 000Da左右，是由1個血色素和1條多肽鏈構成的珠蛋白組成，血色素(鐵卟啉)是由4個吡咯形成的環加鐵離子所組成的，鐵離子(亞鐵狀態/Fe2+，高鐵狀態/ Fe3+)位于環中央[10]，有 6條配位鍵，其中 4個與四吡咯環的N原子相連，另2個沿垂直于卟啉面的軸分布在環面的上下，其中第 5條與肌紅蛋白肽鏈近端的 93 位組氨酸結合，剩下的第 6條鍵可以與不同配體分子結合，形成不同種類的肌紅蛋白分子，進而影響肉色[11]。由此可見，鐵離子化合價和血紅素輔基的第 6位配體是肉色的決定因素[12]。

如果配位鍵結合氧氣，鐵離子的價態是還原態Fe2 +，為鮮紅色的氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin，OMb)；但Fe2+不穩定，珠蛋白部分發生變性時氧結合能力下降，還原態氧氧化增強，容易氧化形成Fe3+，變成褐色的高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin，MMb)[13]；如果鐵離子配位鍵不連接任何其他分子并且為Fe2+時，便是紫紅色的脫氧肌紅蛋白(deoxymyoglobin，DMb)。此外，若第6位配體被一氧化碳(carbon monoxide,CO)占據，則會生成具有明亮桃紅色的碳氧肌紅蛋白(carboxymyoglobin，COMb)[14]，其中MMb的積累是造成肉色劣變的主要原因。

1.2 肌紅蛋白的氧化還原態

肌肉中MMb的形成與氧分壓有直接關系。鮮切肌肉在低氧分壓(< 1.4 mm Hg)下表面主要為DMb，此時血紅素輔基第 6位配體空缺，鐵離子的價態為還原態Fe2+。在有氧環境下暴露 30 min后，血紅素輔基第 6位被氧分子占據，中心的Fe2+被氧化成為Fe3+，鮮切肌肉表面形成鮮紅色的OMb。與此同時，肌肉底部的DMb層向肉的中心延伸，由于氧分壓很低甚至于無氧，所以繼續保持DMb的狀態[15]。隨著在有氧環境下暴露時間的延長，肌肉內部的氧分壓逐漸增大，肌肉表面的OMb層和內部的DMb層間會形成MMb層。若氧分壓逐漸增大至 1.4～25 mm Hg時，MMb層厚度會逐漸增加并向表面移動，當肌肉表面 60% 的肌紅蛋白以MMb存在時，肌肉就呈現褐色，造成肉色劣變[16]。影響MMb的形成的因素很多，總的來說主要有外在和內在兩個方面，外在因素包括溫度、氧分壓和貯藏條件，內在因素包括pH以及其他呼吸過程對氧氣的競爭[17]。

2 乳酸鹽對肉色的影響機制

部分研究者認為乳酸鹽在各個層次上的穿梭作用對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)具有重要的調節作用，其所產生的還原力有助于MMb的還原[18]。過去十年大量學者已經廣泛研究了乳酸鹽在改善冷卻肉色澤穩定性方面的有效性，KIM等[19]觀察到用乳酸鹽注射增強可以延緩肉品的變色速率，增加牛肉背最長肌和腰大肌的紅度值(a*)；張玉斌等[20]通過在牛背最長肌肉糜中添加不同質量分數乳酸鈣發現其均可有效抑制MMb的生成和脂肪氧化的發生，并顯著提高肉色穩定性，其中0.3%的乳酸鈣對穩定肉色有顯著作用，護色效果明顯。研究者認為乳酸鹽主要通過3條途徑來調控肉色：(1)通過與肌紅蛋白直接作用影響肌紅蛋白的氧化還原狀態；(2)通過再生NADH減少MMb的積累；(3)通過抑制脂質氧化間接調控肉色。

2.1 乳酸鹽與肌紅蛋白的直接作用

Mb的氧化還原狀態會直接影響肉色，作為一種氧的載體，它能響應線粒體對O2的需求，將O2從肌膜輸送到線粒體，以促進各種代謝過程的進行，Mb一直被認為是非變構蛋白，在此情況下，肌肉中的O2含量迅速減少從而導致新陳代謝由有氧變成無氧酵解，產生乳酸[21]。研究者由此推測提高乳酸濃度可以激發建立一種防御機制，即Mb結構和功能的改變使得O2擴散到線粒體同時有氧呼吸產生能量。NAIR等[22]研究了關于Mb和乳酸鹽的相互作用機理，通過體外模擬系統的結論指出，在pH為 5.6、 4 ℃ (肉品指標)和pH 7.4、 37 ℃(生理指標)條件下，當乳酸鹽濃度為200 mmol/L時對二者體系內的氧化還原穩定性具有顯著影響，其降低了MMb的含量，因此他們認為肉色穩定性的增加可能是由Mb與乳酸鹽之間的相互作用而引起的。此外，MANCINI等[23]提出乳酸鹽可直接作用于Mb從而提高肌肉色澤的穩定性，分析其作用機制，可能是通過以下2種機制來改變肌紅蛋白的功能：(1)乳酸鹽可以通過某種物理作用阻止氧氣與血紅素輔基的相互作用；(2)乳酸鹽還可能誘導Mb的三級結構發生變化進而改變兩者的結合途徑。因此在添加了乳酸鹽之后就會抑制Mb的氧化，同時顯著降低MMb的形成，并且隨著乳酸鹽的濃度增加，MMb含量會顯著降低(100～200 mmol/L)。

2.2 乳酸鹽與NADH的再生

MMb的積累是造成肉色劣變的主要原因，影響MMb積累的主要有2個因素：肌漿中肌紅蛋白的自動氧化速率和MMb還原的相對速率[24]。MMb的還原系統包括多個非酶系統和酶系統，主要是以MMb還原酶體系為主的酶促反應和以電子呼吸鏈為主的非酶促反應，這2種反應的還原活力總和稱為MMb還原活力(metmyoglobin reduction activity，MRA)[25]。現在人們認為肉中的MMb還原主要是由于發生以NADH為輔酶的酶促和非酶促反應，也就是說NADH成為限制MMb還原的關鍵[26]。

乳酸鹽作為糖異生的前體，可通過位于線粒體上不需氧的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)產生氫質子，產生的氫質子并不以氧作為直接的受氫體，而是以LDH的輔酶NAD+作為直接受氫體產生NADH和丙酮酸[27]。產生的丙酮酸經過丙酮酸脫氫酶生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環產生能量， NADH可作為還原MMb的還原當量[28]，可將鐵血紅素還原為亞鐵血紅素，實現MMb的還原以改善肌肉顏色，有研究者將以乳酸鹽為底物產生NADH的途徑稱為乳酸-LDH體系[29]。由于乳酸-LDH體系存在于線粒體，因此線粒體結構和功能的完整性至關重要，有研究表明在宰后 60 d的肌肉(真空包裝)中仍可以分離出完整的線粒體，這說明在肌肉宰后線粒體會繼續進行氧化代謝進而影響肌紅蛋白的氧化還原狀態[30]。RAMANATHAN等[31]認為乳酸鹽具有充當線粒體呼吸系統底物的能力，由乳酸-LDH體系再生的NADH可以被用于線粒體中的還原酶體系和電子傳遞鏈從而介導MMb的還原，也就是說再生的NADH可通過酶促和非酶促兩條途徑實現MMb的還原，其中以酶促反應為主[32]。

2.2.1 酶促反應中NADH的再生途徑

酶促還原MMb主要依賴于MMb還原酶系統，這些酶系統主要是MMb還原酶(metmyoglobin reductase，MMbR)[33]。MMb還原酶不是單獨的一種酶類，而是一類與肉色有關酶類的統稱，其主要包括線粒體上的細胞色素b5還原酶、肌質網上的細胞色素b等，這些酶類可以在一定條件下還原MMb，實現對肉色的穩定作用[34]。MMb還原酶主要位于線粒體，微粒體中也有少量存在，是一類NADH-依賴型還原酶類[35]。

目前的研究熱點主要集中在NADH-細胞色素b5系統，此系統主要由線粒體膜中的細胞色素b5還原酶、細胞色素b5和NADH組成，其中外膜細胞色素b5還原酶主要位于線粒體，細胞色素b5位于微粒體中，所以是微粒體和線粒體一起控制MMb還原酶系統[36]。NADH-細胞色素b5催化MMb的還原主要與NADH含量有關，其具體的還原過程為： NADH作為電子供體，將電子傳遞至細胞色素b5還原酶，后者將電子轉移給細胞色素b5，被還原的細胞色素b5再將電子傳遞到MMb的血紅素輔基中，從而使Fe3+還原為Fe2+[37]。研究表明MMb還原酶的活性會隨貯藏時間的延長逐漸降低，造成這種現象的主要原因是存在于線粒體中的NADH被耗盡[38]。乳酸鹽作為三羧酸循環中間代謝產物可在線粒體中產生還原當量NADH，產生的NADH可通過穿梭作用在線粒體內外膜之間實現傳遞[39]。更加具體的說，外源添加的乳酸鹽可通過乳酸鹽的穿梭機制使胞質的乳酸鹽通過MCT1(monocarboxy transporter 1，MCT1)轉運到線粒體間膜空間，線粒體內的乳酸鹽可通過乳酸-LDH體系再生NADH，再生的NADH使線粒體表面的NADH-細胞色素b5還原酶系統的反應得到補充，從而提高MMb的還原，達到穩定肉色的目的[40]。

2.2.2 非酶促反應中NADH的再生途徑

MMb的非酶促還原反應主要是指線粒體氧化呼吸作用中的電子傳遞機制[41]，其調節機制為：線粒體膜中的復合物I(NADH-泛醌還原酶)、復合物Ⅱ(琥珀酸-泛醌還原酶)在氧化呼吸鏈中接受NADH反應后脫下的H+，并將脫下的H+傳遞給輔酶Q從而將H+釋放于介質中，再經復合體 Ⅲ(泛醌-細胞色素c還原酶)、細胞色素c和復合體Ⅳ(細胞色素c氧化酶)將電子傳遞給MMb進而發生還原[42]。非酶促反應比酶促反應復雜的多，RAMANATHAN等[43]研究發現與對照組相比，乳酸鈣處理組的NADH濃度增加，線粒體氧消耗增加，MMb的相對含量減少，其結論是乳酸鹽再生的NADH可經過線粒體上的電子傳遞鏈，增加線粒體的氧消耗，降低氧分壓，使線粒體對氧的競爭能力超過肌紅蛋白，為MMb降低創造有利環境，使肌肉中存在大量DMb達到穩定肉色的作用。同時，創造的氧分壓環境支持了電子傳遞鏈中電子的可用性，這些可用的電子能夠通過在線粒體中存在的電子載體來減少肌紅蛋白的氧化，改善肉色[44-45]。

2.3 乳酸鹽與脂質氧化

脂質氧化是影響肉色劣變的原因之一，硫代巴比妥酸值的高低(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)可體現脂質氧化程度。CRUZEN等[46]對牛肉進行乳酸鹽注射處理后發現，經乳酸鹽注射增強的處理組其TBARS均低于對照組，研究者認為這主要是由于乳酸鹽對超氧化物陰離子和羥自由基有清除作用，其可以在起始階段抑制脂質過氧化物的產生[47-48]。

4-羥基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，HEN)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)是最具代表性的 2種脂質氧化產物。陳騁等[49]在pH值 5.6 和pH值 7.4 條件下通過向線粒體中添加脂質氧化的副產物MDA，發現NADH-依賴型MMb還原酶的活力分別下降了 48.97% 和 47.80%，這表明丙二醛能夠抑制牛肉線粒體NADH-依賴型MMb還原酶的活力，從而降低MMb的還原速率加速肉色劣變。一些學者認為， HNE可以結合細胞色素c氧化酶和細胞色素c，而細胞色素c作為中間體，可以將電子從輔酶細胞色素c氧化還原酶(復合體Ⅲ)傳遞給細胞色素c氧化酶(復合體Ⅳ)，細胞色素c氧化酶能夠將電子從細胞色素c傳遞給氧，從而降低線粒體的耗氧率，提高氧分壓，增加肌紅蛋白與氧的結合機率，促進肌紅蛋白氧化[50]。此外，RAMANATHAN等[51]研究表明HEN通過降低乳酸-LDH體系中的乳酸脫氫酶活性減緩NADH的再生，從而使進入電子傳遞鏈的NADH減少，影響MMb的非酶促還原。以上研究進展說明脂質代謝產物主要通過影響線粒體上的酶系和電子傳遞鏈來調控MMb的還原，然而對于外源乳酸鹽如何通過線粒體調控脂質氧化產物的產生進而影響肉色穩定性還需進一步研究。

3 展望

乳酸及其鹽類作為綠色安全的添加劑以防腐和護色為目的已被大量用于肉制品加工業中，近十年的研究主要集中研究三羧酸循環的中間產物對肉色的影響，這些中間產物主要包括丙酮酸、乳酸鹽、琥珀酸鹽、和蘋果酸。其中乳酸鹽對肉色的調控主要借助乳酸鹽的穿梭機制，通過乳酸-LDH體系再生NADH，再生的NADH可通過酶促和非酶促兩條途徑影響MMb的還原。此外，脂質氧化也是影響肉色劣變的原因之一，乳酸鹽也可通過影響脂質氧化調控肉色。最近幾年發現乳酸鹽對肉色穩定性的改善并不是因為乳酸鹽與肌紅蛋白的直接作用，它可能通過線粒體機制來調節，因此從生化角度研究線粒體對于肉色穩定性的調節機制是下一步的研究重點。由于線粒體上存在有MMb還原酶系和大量中間代謝產物，可結合線粒體蛋白質組學研究乳酸鹽對MMb酶系的影響，對蛋白質進行定性和定量研究。同時還可采用電子順磁共振波譜技術、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜等更為先進的分析測試手段和具有高通量、高靈敏、自動化、檢測質量范圍寬等優勢的蛋白質組學研究技術，對線粒體內乳酸-LDH體系進行深入研究，以期更好地闡明宰后冷藏期間乳酸鹽對肉品色澤穩定性的影響機制。