PMA-qPCR技術在發酵食品活菌計數中的應用

陳卓君，魏銘，林果，陳昱锜，梁杉，張柏林，朱保慶*

1(林業食品加工與安全北京市重點實驗室(北京林業大學)，北京，100083) 2(中糧營養健康研究院，北京，102209) 3(北京工商大學,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京，100048)

發酵食品是以農產品、林產品和畜產品等為原料，利用微生物(不包含食品中直接加入的有益微生物)發酵而成的一類特殊食品。發酵食品最初是以延長食品保質期、拓展食品在不同季節的可食性為目的；因其具有獨特的風味和豐富的營養價值，近年越來越受到消費者的歡迎[1]。微生物作為發酵食品的“靈魂”，與發酵食品的品質直接相關，在提高產品貯藏期、富集功能因子和保障安全等方面都發揮著不可替代的作用[2]。因此，準確計數發酵食品中的不同微生物，是研究發酵食品品質形成機理以及工藝改進和產品質量控制的基礎。

傳統的微生物計數方法為菌落計數法，該方法易受主觀影響，繁瑣復雜，耗時耗力，存在較大誤差，既無法區分“可生存但不可培養”(viable but non-culturable,VBNC)狀態下細胞也無法對復雜菌系中的單一菌種進行有效定量。隨著現代分子生物技術的發展，高靈敏度和特異性的實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)也被開發用于發酵食品的微生物計數[3]，該方法的主要缺陷在于難以區分死菌和活菌，使得死菌中存留的大量DNA也可被擴增，導致計數結果出現偏差[4]。近年來出現的疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)偶聯qPCR技術，可以有效避免常規qPCR的缺陷，也可檢測VBNC狀態的微生物。目前，該技術在發酵食品中已被用于多種發酵常見微生物的計數。本文系統地綜述了PMA-qPCR技術的原理、影響因素及在常見發酵食品中應用現狀，同時提出了該技術進一步發展和拓展應用的展望。

1 PMA-qPCR方法介紹

1.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)原理及特點

qPCR是在標準PCR技術基礎上，使用熒光報告基團(包括雙鏈DNA結合染料或在擴增過程中摻入PCR產物的、與PCR引物或探針結合的染料分子)進行DNA擴增，利用具有熱循環功能及熒光染料篩查能力的儀器，每次循環結束后通過熒光染料檢測DNA含量，熒光染料產生的熒光信號與生成的PCR產物分子(擴增片段) 數成正比。利用反應指數期采集的數據，生成有關擴增靶點起始量的精度極高的定量信息。與傳統PCR相比，熒光定量PCR具有特異性更強、靈敏度更高、檢測周期更短、自動化程度高等特點。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，實時熒光定量PCR技術在微生物計數方面得到了廣泛的應用[5]。然而微生物在自然環境中以多種生理狀態存在：可培養的活菌，活的非可培養狀態，具有完整結構但無生物活性的死菌以及膜損傷死菌。qPCR技術雖能克服傳統計數方法無法檢測VBNC狀態下細胞的缺陷，但無法區分死活菌DNA，這對活菌計數帶來巨大的挑戰[6]。

1.2 PMA-qPCR檢測活菌的機理

膜損傷細胞沒有代謝活性，適宜條件下培養難以恢復生長，因此將膜完整性作為評判活菌標準已被多數學者接受[7]。基于活菌定量條件，疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide，PMA)常被用于qPCR的前處理步驟[8]，待測菌與適宜濃度PMA避光條件下孵育一定時間，經光鈍化后即可提取活菌DNA。

PMA是一種具有高親和力的光敏性DNA結合染料，如圖1所示，該染料自身熒光弱，與核酸結合后熒光信號大大增強。在DNA提取之前將PMA與待測樣品混合，PMA會選擇性的進入膜損傷細胞并嵌入雙鏈DNA結構中，每分子染料可與4～5個核苷酸相結合。在可見光(最大吸收峰為464 nm)作用下，PMA分子中疊氮基團分解產生高活性的氮烯類化合物，與DNA分子發生共價交聯反應生成沉淀，進而抑制膜損傷細胞qPCR過程中DNA的擴增。溶液中殘留的過量染料與水分子經光照反應生成羥胺化合物，進而失去交聯活性，不會影響后續活細胞DNA擴增[8]。利用PMA選擇滲透性和qPCR特異性，能夠顯著提高檢測速度和靈敏度。

圖1 PMA與DNA反應原理示意圖[9]Fig.1 Schematic diagram for the reaction bewteen PMA and DNA

2 影響PMA-qPCR檢測效率的因素

2.1 目標微生物

表1匯總了利用qPCR對常見發酵微生物計數的目的基因、引物序列等信息，諸多學者針對實驗菌株會選擇不同目的基因，細菌通常采用16S rDNA編碼基因，而26S rDNA及ITS編碼基因常用于酵母的靶點設計。

表1 不同微生物qPCR檢測目的基因的選取及引物列表Table 1 Selected genes and related primers used in qPCR for different microorganisms

續表1

微生物 引物 目的基因 擴增長度/bp引物序列(5’-3’) 參考文獻Tet_R107AATCAACACCAACCGAGAATCC[38]真菌ITS1qITS2ITS1-5.8SrDNA-ITS2290TCCGTAGGTGAACCTGCGGTTYGCTGYGTTCTTCATCG[16] [17]酵母YEAST-F26S rDNA124GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGC[18]YEAST-RTCTCTTTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT[18]釀酒酵母CESP-FSCER-RITS2 和5.8S rDNA175ATCGAATTTTTGAACGCACATTGCGCAGAGAAACCTCTCTTTGGA[18][18]布魯氏酒香酵母DekITSITS308GACACGTGGAATAAGCAAGG[24]BruxITRATTATCCCCTCACTCCCCTC[24]葡萄有孢漢生酵母CESP-FHUV-RITS2和5.8S rDNA121ATCGAATTTTTGAACGCACATTGAACCCTGAGTATCGCCCACA[24][24]釀酒酵母SC1dSC1rRAPD bands301ACATATGAAGTATGTTTCTATATA-ACGGTGTGGTGCTGGTGCGGATCTA[18][18]

研究表明[10]，對不同微生物進行PMA處理時應進行優化時，目標菌種不同(特別是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細胞膜結構差異)可能對DNA活性染料效果有很大影響。革蘭氏陰性菌細胞壁含有外膜，而革蘭氏陽性菌主要為肽聚糖層[4]，這種差異使PMA可以更快滲透入膜損傷的革蘭氏陰性菌，如果兩種細菌存在于同一環境樣本中，最終可能產生群落定量偏差[11]。值得指出的是，現階段研究多針對于細菌，對真菌和病毒的描述較少。同時為了正確地描述食品生態系統中的微生物種群，需要考慮的重要因素之一是待擴區域的選擇。目標基因必須有2個基本特征: (1)存在于待檢測的微生物組的所有成員中；(2)具有可設計通用引物的保守區域和可分化的可變區域[12]。針對目的基因進行正確的引物設計也至關重要，LAI等[13]基于內轉錄間隔基因和23S rDNA基因，設計了格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)和唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)特異性引物，從而可以有效計數益生菌產品中兩種乳酸菌活細胞值。

2.2 PMA處理條件

除待測菌自身差異外，PMA處理條件也是影響擴增效果的重要因素，關鍵點包括：PMA濃度、暗反應時間、光反應時間[14-19]，三者需要針對反應體系進行平衡優化(表2)。

PMA濃度應以能夠最大程度抑制死菌，同時不影響活菌的后續定量為先決條件。TANTIKACHORNKIAT等[20]在研究中推測PMA的最佳濃度可能與細胞密度有關：細胞密度越高，則需要更高的PMA濃度才能有效抑制死菌DNA的擴增。有研究表明密度處于106～107CFU/mL的酵母和密度近似108CFU/mL的細菌得到準確定量結果的條件均為6 μmol/L PMA。

表2 針對不同微生物PMA處理條件優化Table 2 The optimal conditions of the PMA treatments for different microorganisms

暗反應時間的長短決定了PMA嵌入DNA的充分程度，嵌入DNA的PMA在強光照射下與DNA共價交聯，未反應PMA則被鈍化，光反應時間決定后續活菌DNA擴增效率。ANDORR等[21]測定釀酒酵母時發現使用6 μmol/L PMA處理樣品，進行10 min暗反應后采用兩次相隔1 min的30秒曝光方法定量結果更為準確。SHAO等[22]使用了20 μmol/L PMA進行20 min光鈍化，可有效檢測德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiissp.)是否進入VBNC狀態，這與NOCKER等[8]針對純凈環境培養細菌優化后的處理條件有所不同。

3 PMA-qPCR計數在發酵食品中的應用

3.1 酒

釀酒是一種復雜的生物化學反應過程，受到多種微生物和環境因素的影響，如何對酒樣中微生物定性定量，對工藝控制及成品酒貯存至關重要。現階段以此方法進行酒類研究較少，主要集中于葡萄酒。釀造中，隨著主要發酵產物乙醇濃度的增加，酒樣中細胞的膜流動性受到影響，對膜蛋白產生毒性，從而抑制細胞生長甚至導致死亡[23]。ANDORR[21]推測，發酵過程中高濃度酒精導致死菌大規模的出現，可能會對活菌定量產生影響；在實驗中添加106個/mL膜損傷菌進行檢測后發現，過量死亡細胞的存在并未干擾到菌群密度為103～107CFU/mL酵母菌的計數結果。將優化后的PMA處理條件用于發酵酒及陳釀酒中總酵母、釀酒酵母、非釀酒酵母和腐敗酵母的檢測，結果發現不同生理狀態下酵母均可被快速定量。同時在不同葡萄酒酒樣中利用Ct值和標準曲線對微生物進行計數時，應考慮基質的影響。RIZZOTTI等[24]在檢測10種葡萄酒中酵母、乳酸菌及醋酸菌密度時，針對不同基質制作了相應標準曲線，大幅降低環境因素對結果的影響。

PMA-qPCR技術在其他酒類中也有應用，VENDRAME等[25]以布魯氏酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)為目標菌株，建立起了一套能夠在9 h快速檢測酒樣中是否存在腐敗酵母的方法，檢測限在紅酒、白酒、啤酒中分別為0.83、0.63、0.23 lg CFU/mL。中國傳統真菌發酵米酒中，LV[26]優化了對于釀酒酵母(S.cerevisiae)，植物乳桿菌(L.plantarum)和紫紅曲霉((M.purpureus)的PMA處理條件，同時對qPCR、PMA-qPCR、RT-qPCR處理結果進行了對比，發現PMA-qPCR與傳統計數方法最為擬合，同時檢測限較低，據此建立了監控米酒發酵過程中整體菌群動態變化的高效途徑。

3.2 發酵乳

發酵乳是乳和乳制品在發酵菌的作用下發酵而成的酸性凝乳狀制品，主要包括酸奶、奶酪及開菲爾等。發酵乳常被用于引入除發酵劑外益生菌的載體，益生菌是一種通過改善腸道微生物平衡從而對宿主施加有益影響的微生物添加物，乳桿菌和雙歧桿菌是發酵乳生產中常使用的兩種益生菌，用于改進發酵乳的口感、質地等感官特性，增強發酵乳的健康性能[27]。國際食品法典標準發酵乳卷[28](CODEX STAN 243—2003) 中規定在最低保質期內發酵乳中發酵微生物應是大量存活的，在除了用于發酵的特定發酵劑之外，發酵乳中微生物的計數至少要有106CFU /g。所以在發酵乳的生產和保存中微生物的存活率有直接影響。

3.2.1 酸奶

酸奶主要是以新鮮牛乳為原料，經乳酸菌發酵形成的風味獨特、營養豐富的功能性乳制品。酸奶是益生菌最常見且經濟的載體，在傳統發酵劑基礎上，發展益生菌酸奶可有效解決耐藥菌株問題，同時滿足人民對健康食品的不斷需求[29]。以混合菌株作為發酵劑是增強酸奶益生性的較優方法，GARCA-CAYUELA等[30]利用PMA-qPCR檢測了貨架期內(28 d)及超出貨架期30和60 d的酸奶樣品中種水平上嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)STY-31、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)LBY-27、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)LA-5、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacilluscaseisubsp.casei)LC-01 和雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)BB-12的動態變化；結果發現, PMA-qPCR可以在設計了種間特異性引物的基礎上，在復雜微生物環境條件中做到105CFU/mL菌濃度檢測范圍內的簡單快速計數，實驗中不會出現交叉污染現象，菌株的生存能力在貨架期后才會減弱。目的基因的選擇與特異性引物的設計在定量微生物方法中的重要性也被SCARIOT等[31]進一步證實，利用PMA-qPCR檢測副干酪乳桿菌(L.paracasei)ATCC 10746的tuf基因，觀察其在純凈環境和酸奶發酵過程中的生存狀況，得到不同基質中標準曲線平均效率為94%和96% (R2> 0.98)，兩個樣本的檢測限(LOD)均為104CFU/mL。將發酵1和30 d的酸奶進行對比，發現目標菌株仍保持在108CFU/mL，qPCR方法得到的計數值高于PMA-qPCR。這些研究證明PMA-qPCR技術可用于在復雜酸奶發酵環境中快速定量益生菌，幫助生產者選取生存能力更強的優勢菌株。

3.2.2 奶酪

奶酪同樣是一種以混合發酵劑發酵的食品，作為益生菌的優良載體，具有獨特的風味和質地。PMA-qPCR技術已被用于監控切打干酪(chadder cheese)發酵過程中益生菌生長情況，éMILIE[32]探究了添加3種益生菌對車打干酪發酵及成熟期的影響，樣品以乳酸乳球菌為發酵劑，分別添加雙歧桿菌(B.animalissubsp. lactis)BB-12、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)RO011、瑞士乳桿菌(L.helveticus)RO052和3種益生菌混合物，結果表明,益生菌添加會影響發酵菌株的生長，混合菌株之間雖存在抑制作用，但在成熟期奶酪中仍能保持較高活性(lg 9 CFU/g)。除此之外，也有學者使用PMA-qPCR技術與體外模擬實驗相結合從而得出比培養依賴型定量更為高效的方法。VILLARREAL等[33]使用qPCR、PMA-qPCR結合平板計數法評價了嗜酸乳桿菌La-5、雙歧桿菌BB-12和清酒乳桿菌(L.sakeisubsp. sakei)2a在小瑞士奶酪貨架期間的存活率，發現3種方法在測定初期沒有較大差異，然而隨著體外誘導試驗的變化，不同方法之間差異增大，電鏡結果顯示qPCR計數了大量膜損傷細胞而PMA-qPCR克服了這個問題。在檢測中顯示BB-12菌株有較好的生存能力，能夠維持在6 lgCFU/g及以上。基于這些研究，ERKUS等[34]發掘了PMA-qPCR更大的應用潛力，以8種混合菌株為發酵劑的GUODA干酪在成熟過程中會出現大量膜不完整細胞，這給宏基因組帶來了巨大挑戰，用PMA處理發酵期和成熟期樣品后選擇性剔除了膜損傷細胞，從而可以對奶酪微生物群落中活細胞進行更高效的宏基因組鑒別分析。

3.2.3 開菲爾

開菲爾(Kefir)是一種利用開菲爾粒(Kefir grain)，對牛奶、羊奶等發酵，得到的含醇、酸及少量CO2的發酵乳。開菲爾粒是一種天然存在的混菌發酵體系，內含多種微生物，分析其菌相組成是探討發酵過程、代謝機制及確保發酵乳安全性的前提[35]。PORCELLATO等[36]將PMA-qPCR技術與變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)及自動核糖體間隔基因分析(automated Ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)聯用，探究了3個生產批次的開菲爾產品在貨架期及超過貨架期兩周內的菌群動態變化。結果表明在儲存過程中，PMA處理后的Kefir樣品與原始樣品中菌群存在顯著差異，作為發酵劑的主要構成菌株鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)濃度明顯下降，DGGE及ARISA檢測不同批次樣品中均出現了污染微生物。這種直接從食品中提取DNA進行分析的方法為開菲爾類發酵產品的研究提供了新的思路。

3.3 魚露

魚露因富含谷氨酸而被作為食品中天然的增鮮劑。它以低值魚蝦或水產品加工下腳料為原料，利用環境、魚自身的酶系及耐鹽酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物在一定條件下發酵而成[37]。因其自然發酵周期較長(12～18個月)，生產中通常采用添加發酵劑的形式加速發酵和提高產品品質，所以監測添加菌種的生長變化對于發酵過程的質控是必要的。為了快速檢測出富含28株原生菌株的復雜初始發酵環境中添加發酵劑的生長情況，UDOMSIL等[38]使用基于目標菌株堿性絲氨酸蛋白酶X基因(aprX)及內轉錄間隔區(ITS)設計的特異性引物進行精確定量，在優化后的PMA處理條件下，對嗜鹽性蛋白酶產生菌(Virgibacillussp.)SK37和嗜鹽四生球菌(Tetragenococcus.halophilus) MS33的最低限可達到103、102CFU/mL。實驗結果證實PMA-qPCR檢測的穩定性未受到復雜基質的影響，所以可被用于監測發酵劑發酵過程的實用工具(表3)。

表3 不同發酵食品活菌檢測線性范圍及最低檢測限Table 3 The detection limits of PMA-qPCR technique for enumeration of living microbes in different fermentation foods

4 展望

PMA-qPCR技術是近年來較為新型的微生物計數技術，以其較高的工作效率和準確的定量結果受到很多學者的青睞。本文綜述了近年來PMA-qPCR技術在發酵食品科研領域的應用情況；值得注意的是，由于特定發酵食品內環境的復雜性和特異性，在實際應用中需針對相應的食品基質進行PMA反應條件優化。