不同部位驢肉風味物質差異分析

李秀，楊燕，DAUDA SA-ADU ABIOLA，成向榮，梅娜娜，王東亮*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(國家膠類中藥工程技術研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 東阿，252201)

自古人們對驢肉風味已有基本的感性認識，素有“天上龍肉，地下驢肉”之說，驢肉有益于人體健康，比如補氣血、補腎、利肺等作用，特別是對止煩、安神清腦有顯著效果[1]。現代驢肉營養成分的分析結果表明，驢肉具有較高的營養價值，具有“三高三低”的特點：高蛋白，高必需氨基酸，高必需脂肪酸；低脂肪，低膽固醇，低熱量[2-3]。但由于早期驢主要作為交通運輸和農業役用家畜，且飼養和食用具有區域具有很強的地域性，主要集中在西北等欠發達地區，因此極大制約了驢肉及其制品的開發及市場的發展。目前對驢肉的研究主要集中在其脂肪酸組成和功能評價以及驢肉產品開發[4]，關于驢肉風味的研究較少，對形成驢肉特有香味、滋味的化學物質基礎尚未明確，尚缺乏比較不同部分驢肉風味差異的研究。而目前人民生活水平日益提高，從之前的溫飽型結構已經轉變到營養型結構。越來越多的人們青睞驢肉及其制品，因此對驢肉風味研究迫在眉睫。

風味是評定肉品品質的重要指標之一，其是由產生氣味的揮發性成分和產生滋味的非揮發性物質構成[5-6]。基于風味特征成分的復雜性與微量性，本文先使用電子鼻評估4個部位驢肉的香氣特征，后利用SPME技術富集揮發性風味物質，并利用氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法進行組分分析，研究不同部位驢肉揮發性風味物質組成與特點，并使用高效液相色譜儀和氨基酸分析儀對驢肉中形成滋味的呈味核苷酸和游離氨基酸進行測定和評價。應用多種分析方法對不同部位驢肉的風味物質進行鑒定，找出體現驢肉風味差異的主要物質，建立風味組分與感官聯系，以期為驢肉風味物質研究提供理論基礎，為推動驢肉及其制品的深開發和驢肉資源利用提供基礎，并為后期實際生產提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢肉，由山東東阿阿膠股份有限公司提供；將原料按頸、脊、肋、腿4個部位進行分割、分裝、放入80 ℃ 的恒溫水浴鍋，煮30 min，冷卻至室溫，密封待測。二氯苯(分析純AR)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；HClO4、KOH(分析純AR)，上海滬試實驗室器材股份有限公司；次黃嘌呤、肌苷酸、鳥苷酸、腺苷酸、肌苷,美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

科學AR224CN電子天平，奧豪斯儀器有限公司(中國)；HeraclesII快速氣相色譜電子鼻，Alpha MOS S.A.有限公司(法國)；TSQ Quantum XLS三重四級桿氣質聯用儀，賽默飛世爾科技有限公司(美國)；Shimadzu LC20A高效液相色譜分析，島津(日本)；L-8900 高速氨基酸分析儀，日本株式會社日立高新技術科學那珂事業所(日本)；HH-3A數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司(中國)；5804R離心機，Eppendorf艾本德(德國)；OHAUS pH計、20 mL頂空瓶，Agilent科技公司(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HeraclesⅡ快速氣相電子鼻

把頸、脊、肋、腿4個部位的驢肉分別攪碎，各樣品分別稱取5.000 g于20 mL的頂空瓶中，加蓋密封，每組設置5個平行樣品。參考陳修紅等[7]的研究方法，設置好檢測程序之后直接開始檢測分析樣品。

2根不同極性的色譜柱的參數分別為：DB-5-FID1和DB-1701-FID2，柱長2 m，柱內徑1 mm，程序升溫速度10 ℃/s，于20 mL頂空瓶中放入5.0 g的樣品，儀器進樣體積2 000 μL，進樣速度125 μL/s，進樣口溫度200 ℃；搜捕井初始溫度50 ℃，持續時間18 s； 檢測器溫度260 ℃。

1.3.2 SPME-GC-MS檢測

稱取1.80 mg的1,4-二氯苯，用高純水定容至100mL容量瓶中，配制成質量濃度為0.018 g/L的1,4- 二氯苯溶液，作為內標物溶液進行后續實驗的分析。

參考徐微微等[8]研究方法，并適當進行調整。頂空固相萃取條件：萃取頭型號50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取頭經過250 ℃、30 min老化后，于80℃加熱托盤中，恒溫頂空萃取50 min；結束萃取后，將萃取頭的針頭拔出后立即插入到GC進樣口，2 min解析完成本次試驗的檢測。

氣相色譜-質譜條件：DB-5毛細管柱(Agilent J&W GC，30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；柱初溫40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升溫到240 ℃，保持5 min；載氣為99.999%高純He，流量1.0 mL/min；不分流模式進樣。

質譜條件：傳輸線和離子源溫度240 ℃；掃描范圍35～500 m/z；電離電壓70 eV。

1.3.3 呈味核苷酸的分析方法

參考DAI等[9]的方法并作適當修改。稱取適量的標準品使用高純水進行配制成濃度1 000 μmol/L母液，并按梯度稀釋為100、40、20、10、5 μmol/L，進樣量為20 μL，根據溶液在標準品內保留時間定性，將測得的峰面積作為橫坐標，各標準品濃度為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線見表1。

取樣品在絞肉機中充分攪碎混勻，稱取約5 g于50 mL離心管中，加入預冷的50 g/L高氯酸鹽15 mL，用高速勻漿器完全均勻化后，用冷凍離心機10 000 r/min離心5 min。上清液轉移至100 mL燒杯，加入預冷的50 g/L高氯酸15 mL，搖勻，將上清液再離心、混合，重復上述操作2次。將上清液pH調至6.5，高純水定容至50 mL容量瓶中。濾液經0.45 μm微孔膜過濾，用于高效液相色譜分析。

色譜柱：Galaksil EF-C18Bio；流動相：A：0.05 mol/L NaH2PO4-水，B：甲醇，SPD-20A紫外檢測器檢測波長：260 nm，進樣量20 μL。

液相條件： 0～6 min,0%甲醇；6～7 min,0%～5%甲醇；7～16 min,5%甲醇；16～17 min,100%甲醇；17～30 min，100%甲醇。

混合標準品溶液的HPLC圖譜(圖1)，在驢肉樣品中每一個單獨的標準品的出峰順序和保留時間依次為:鳥苷酸(5′-GMP)，4.939 min；肌苷酸(5′-IMP)，5.344 min；次黃嘌呤(Hx)，6.513 min；腺苷酸(AMP)，8.804 min；肌苷(HxR)，15.579 min。對梯度濃度的核苷酸標準品進行分析，建立5種核苷酸的標準曲線如表1所示，標準曲線性關系良好(圖1)。

圖1 核苷酸混合標準品溶液的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of nucleotide mixed standard solution

表1 5種核苷酸的定量標準曲線Table 1 Quantitative standard curve of 5 nucleotides

呈味核苷酸 線性回歸方程R25'-GMPY=12 636x+4 211.50.999 95'-IMPY=8 147.3x-4 717.90.999 9HxY=9 825.1x+31 4430.995 8AMPY=15 176x-3 953.70.999 9HxRY=8 825.4x+2 353.60.999 9

鮮味核苷酸含量計算方法：基于擬合的標準曲線和如下公式(1)求得：

X=C×V×m[10]

(1)

式中：X,檢測目標物質的含量mg/100g；C,目標物質的濃度，mg/mL；V,樣品的體積，mL；m,樣品稱量質量，g。

滋味活性值(TAV)計算方法如公式(2)：

(2)

式中：C,所測滋味物質的質量；T,所測物質的氣味閾值。

1.3.4 游離氨基酸的分析方法

取適量待測樣品在絞肉機中充分攪碎混勻，準確稱取5.0 g置于離心管中，加入30 mL高純水，高速均質后超聲分散30 min，離心，將上清液轉移到50 mL的容量瓶中，用高純水定容，經0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

參考KOBAYASHI等[12]方法進行分析，分析柱為Na型離子交換色譜柱(4.6 mm×60 nm, 3 μm),以鋰鹽緩沖液為洗脫液，雙通道檢測，流速分別為 0.45、0.35 mL/min，檢測波長分別為420、570 nm，柱溫為57 ℃， 柱后衍生，衍生劑為茚三酮緩沖液，反應溫度135 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同部位驢肉電子鼻分析

HeracleⅡ快速氣相電子鼻運用2根不同極性色譜柱同時進行分離經FID檢測器檢測，主要通過主成分分析(PCA)對樣品的原始數據向量進行線性轉換，通過改變坐標軸來達到區分樣品的目的并根據保留指數指定庫對樣品的風味進行分析并找出可能的差異物質。

主成分分析是由PCA的貢獻率決定的，從PCA的二維圖來看，樣品在橫、縱坐標單向距離代表了樣品間差異性的大小；如果2個樣品單向的橫向距離越大，表明樣品間存在大差異，反之則小；由于縱向距離對于樣品間貢獻率小，所以對樣品間差異性影響也較小[13]。據田懷香等的研究[14]，70%～85%的總體貢獻率可以進行實驗檢測。由圖2得知，PC1、PC2和兩累加的方差貢獻率分別為68.33%，23.67%和92.00%，驢腿肉與其他3部位驢肉在橫坐標上的水平距離較遠，肋、頸、脊肉在橫坐標上的水平距離較近說明驢腿肉與另外3個部位驢肉存在明顯的揮發性風味差異。

1-驢腿肉；2-驢肋肉；3-驢脊肉；4-驢頸肉圖2 不同部位驢肉的電子鼻PCA圖Fig.2 The PCA image of electronic nose analyse for different parts of donkey meat

由圖3可知，在2根色譜柱的對應下，找出不同部位驢肉的風味存在差異性的保留時間，初步了解不同部位驢肉所存在的差異性物質。實驗進一步對差異性化合物進行定性分析，采用儀器自帶的AroChemBase數據庫進行比對，結果顯示可能的風味化合物如表2所示。

圖3 不同部位驢肉的電子鼻Bar圖Fig.3 The bar image of electronic nose analyse for different parts of donkey meat

表2 不同部位驢肉可能的風味差異成分信息Table 2 Different composition in different parts of donkey meat

名稱RI DB-5-FID1RI DB-1701-FID2 氣味信息乙醛439491刺激性的辛辣氣戊醛699780特殊香氣甲苯773825刺激性芳香氣正己醛802895青草氣[15]

2.2 不同部位驢肉GC-MS分析

為了對電子鼻分析中的數據進行驗證和分析其他揮發性成分的組成對不同部位驢肉進行GC-MS分析。如表3和圖4所示，4個部位驢肉中共檢出53種揮發性物質，分別占總頸、脊、肋、腿部位總檢出物質的91.92%、92.17%、89.5%、94.78%；其中硅氧烷類物質5種，其可能是固相微萃取頭上脫附的復合材料，內標物質有1種(1,4-二氯苯)，農藥殘留物質1種 (氯唑磷)；有效風味物質46種，其中烴類化合物8種、 醇類化合物10種、醛類化合物19種、脂類化合物5種、酮類化合物1種、呋喃類化合物1種、酸類化合物1種，其他類化合物3種，分別占總頸、脊、肋、腿部位總檢出物質的14.02%、22.14%、43.96%、67.81%，該結果與電子鼻數據分析顯示，驢腿肉揮發性風味物質最豐富；肋部次之，脊部與頸部最少，含量相近，與這一結果一致。進一步分析如表2～表4所示，在驢肉中揮發性風味物質主要以醛類為主，在頸、脊、肋、腿部中，醛類分別占76.39%、79.63%、82.07%、76.64%。在19種檢出的醛類物質中，具有清香和青草味的正己醛含量最高，占總醛類成分的56.6%～70.56%。

表3 不同部位驢肉的53種揮發性風味成分Table 3 The 53 volatile flavor components of cooked donkey meat

圖4 不同部位驢肉揮發性成分的GC-MS離子流圖Fig.4 Ion chromatogram of volatile flavor compounds in different parts of donkey meat

正己醛的高含量與正己醛合成途徑的多樣性有關，在油酸、亞油酸和花生四烯酸氧化過程中產生的氫過氧化物都可以分解為正己醛，一些不飽和的醛類物質如2,4-二癸烯醛也可以被裂解形成為正己醛[16]。這與尤娟等[4]研究驢肉脂肪和脂肪酸組成特點中表明，驢肉中不飽和脂肪酸含量(55.8%)豐富，亞油酸(10.1%)和花生四烯酸(2.0%)含量豐富這一結果相一致。本實驗中也檢測到其他的醛類物質，如庚醛、辛醛、壬醛和一些小分子醛類，它們都是不飽和脂肪酸的氧化產物，庚醛來源于亞油酸的氧化分解，辛醛來源于亞麻酸的氧化分解，壬醛來源于花生四烯酸的氧化分解；但是風味性醛類物質都是來自不飽和醛，在氧化降解為短鏈的醛類[17-19]，這與文獻研究表明揮發性氣味主要來源于肉在受熱過程中所產生的不飽和醛酮等有關相一致[20]。

結合不同部位熟驢肉揮發性風味物質的快速電子鼻和GC-MS分析結果，通過成分比對驗證，進一步確認了影響驢頸、脊、肋、腿肉風味差異的主要風味成分為正己醛。根據內標化合物1,4-二氯苯的濃度，計算驢肉頸、脊、肋、腿的正己醛含量分別為4.85×10-3，2.024×10-2， 1.572×10-2，4.653×10-2mg/100 g，均遠遠高于正己醛的風味閾值0.45×10-3mg/100 g，進一步表明，正己醛是影響驢肉風味的重要揮發性風味成分。

驢肉中測得醛類化合物含量高不僅由于其在相對含量上有絕對優勢，而且其香氣閾值比較低，在脂質氧化過程中形成速度快，對風味有重要影響。碳鏈的長度和化合物的味道存在一定的規律性，隨著碳原子數的增加，相應的醛類化合物會呈現出不同的風味，含3～4個碳原子的醛具有強烈的刺激性氣味，5～9個碳原子的醛表現出芳香、油香，大多數的醛都有一種清新芳香的氣味，具有較大分子質量的醛具有橙皮的風味[21]。除了醛本身對風味的貢獻之外，它們還可以產生羰氨反應來產生香氣前體(表4)。

2.3 不同部位驢肉呈味核苷酸分析

驢肉風味中的非揮發性成分主要是核苷酸和氨基酸，其中呈味核苷酸是肉類食品很重要的呈鮮味物質。最具代表性的呈味核苷酸是5′-GMP和5′-IMP。

表4 不同部位驢肉中各類揮發性風味物質 占有效風味物質的比例Table 4 The proportion of various volatile flavor substances in different parts of cooked meat

注：同行上標有相同字母表示差異不顯著(P≥0.05)，上標均不同者表示差異顯著(P<0.05)。

兩者的含量可以間接體現驢肉味道和口感。肉的成熟分為4個階段：糖原酵解、死后僵直、僵直解除的成熟。在動物死后的初期，糖原在一系列酶的作用下，降解產生乳酸并堆積在體內，使肌肉的pH降低以及肌肉中ATP分解，在ATP降解過程中會產生腺苷酸、5′-肌苷酸、次黃嘌呤、腺苷二磷酸、肌苷、核糖[22]；宰后動物的肌肉會產生肌苷酸以及相應核苷酸降解產物，肌苷酸降解為次黃嘌呤就會影響驢肉的味道，驢肉苦味增加與肌苷在其中的含量升高有關；所以本試驗用高效液相色譜法對4個部位驢肉次黃嘌呤、肌苷、肌苷酸、腺苷酸和鳥苷酸含量進行分析(圖5)。

圖5 不同驢肉的呈味核苷酸含量Fig.5 The taste nucleotide content of cooked donkey meat in 4 parts

由圖5可以看出，4個部位熟驢肉中呈味核苷酸以5′-IMP和HxR為主，而5′-GMP、AMP、Hx含量相對較低。畜禽類動物屠宰、冷卻成熟后，ATP依次分解為ADP、AMP、IMP、HxR、Hx，驢肉中5′-IMP含量較高，說明AMP分解主要產生5′-IMP，且累積速度遠大于其分解速度。比較不同部位熟驢肉的呈味核苷酸總含量，腿部>肋部>頸部>脊部，表明腿、肋部的滋味比頸、脊部鮮美。

5′-GMP和5′-IMP是最具代表性的呈鮮味核苷酸，其風味閾值分別為12.50，25.00 mg/100g，計算不同部位驢肉滋味活度值(TAV)，其結果如表5所示。TAV值>1，表明該核苷酸的滋味能被人們感知，而<1時則不被人們感知[23]。驢肉中5′-GMP的TAV值均<1，因此5′-IMP是驢腿、肋、頸肉的主要呈味核苷酸，HxR是驢脊肉的主要呈味核苷酸。不同部位驢肉的風味特點，提出其適用于不同的加工方式以提升或保留其鮮香味，更有利于驢肉在加工生產方面開發新的方向(表5)。

表5 不同部位驢肉中5′-GMP和5′-IMP的TAV值Table 5 TAV values of 5′-GMP and 5′-IMP in the different parts of cooked meat

注：同列上標有相同字母表示差異不顯著(P≥0.05)，上標均不同者表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.4 不同部位驢肉呈味氨基酸分析

由表6可以看出，驢肉中主要氨基酸有精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和甘氨酸(Gly)，它們呈現的氨基酸含量較豐富。驢肉中氨基酸總量中驢腿>驢頸>驢脊>驢肋，分別為140.33、126.65、105.20、104.33 mg/100 g。腿、頸部游離氨基酸含量相對較高，可能腿、頸部位的滋味更鮮美。

決定食物蛋白質營養價值高低的因素為必需氨基酸的含量、種類和其比例。不同部位驢肉的檢測結果表明，必需氨基酸都被檢測出，這也在一定程度上說明驢肉的營養豐富[24]。氨基酸類的化合物在肉類食品中都是呈現風味的物質。天冬酰胺(Asn)、組氨酸(His)、脯氨酸(Pro)是肉中的主要呈酸味的氨基酸；丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)和蘇氨酸(Thr)是主要呈甜鮮味的氨基酸；谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是主要呈鮮味氨基酸；甲硫氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)是主要呈苦味氨基酸。所以，可能會影響其味道的是谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量。風味物質主要通過疏水相互作用與水合蛋白質相結合，任何影響疏水作用或蛋白質表面疏水性的因素都會影響風味結合，具有強疏水性的氨基酸味道更苦，反過來就是甜味更重[25]。

表6 不同部位驢肉中呈味氨基酸的含量 單位：mg/100g

注：NEAA表示非必需氨基酸，EAA表示必需氨基酸，TAA表示總氨基酸。

表7顯示，呈甜味的氨基酸在驢肉的各部位中含量最高，其次為呈苦味的氨基酸和呈鮮味的氨基酸。在驢肉不同部位氨基酸數據對比中發現，驢頸部的呈味氨基酸含量最高，預示著驢頸肉可能風味最好。

表7 不同部位驢肉中呈味氨基酸含量及 占氨基酸總量的百分比Table 7 Content of amino acids in the different parts of cooked meat and percentage of total amino acids

3 結論

通過電子鼻和頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用分析，驢腿由較其他3個部位所含有的形成氣味的揮發性物質較多以青草味的正己醛為主，而肋、脊、頸三者的差異不明顯；但是在呈味氨基酸結果中發現，驢頸肉呈味氨基酸含量最高，所以在呈味氨基酸中驢頸肉可能是呈現滋味最好的部位；在呈味核苷酸檢測中發現，驢腿部和驢肋部含量高于驢頸部和驢脊部；綜上所述，驢腿肉具有較重的風味氣味，而驢頸肉滋味更鮮美，味道和口感更佳，是生產和加工工藝上選擇的最佳部位。并確定出醛類物質是影響驢肉揮發性風味的主要物質，且正己醛是影響驢肉風味最關鍵的揮發性成分。