文蛤酶解產(chǎn)物的抗氧化活性評(píng)價(jià)及其組成分析

胡大偉，李恒*，蔣敏，丁海龍，王松濤，沈才洪，許正宏，史勁松*

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州，646000) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

文蛤(MeretrixmeretrixL.)是我國沿海地區(qū)常見的經(jīng)濟(jì)貝類，其肉質(zhì)鮮美，食用與藥用歷史悠久。《本草綱目》中記載了文蛤的“治療瘡、癤、腫毒，消積塊，解酒毒”功效；《傷寒論》中也述及文蛤可治療“飲水不止”的消渴之癥[1-2]。近代研究進(jìn)一步明確了文蛤具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞等多種藥理作用[3-7]。其中，抗氧化活性是其他各類生理功能的基礎(chǔ)[8-10]，可作為活性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)依據(jù)。

蛤類等海洋生物是優(yōu)良的活性蛋白、活性多肽的來源。采用生物酶酶解的方式可以促進(jìn)活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)海洋蛋白資源的高值化利用。文蛤中含有多種營養(yǎng)與活性成分，其中蛋白含量約占干物質(zhì)總質(zhì)量的50%以上[11-13]。蛋白的酶法水解是近年廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)生物技術(shù)，動(dòng)物組織中的蛋白質(zhì)、蛋白復(fù)合物等大分子原料可被蛋白酶酶解成肽類等小分子物質(zhì)，從而利于后續(xù)濃縮和活性物質(zhì)提取。

本研究以文蛤軟體為原料，通過篩選酶解用酶進(jìn)而確定酶解工藝條件，在評(píng)價(jià)酶解物抗氧化活性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)抗氧化活性的組成物質(zhì)進(jìn)行分析，探索具有抗氧化活性的文蛤小分子肽類物質(zhì)的構(gòu)成特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文蛤軟體：南通昌華水產(chǎn)食品有限公司，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫幻附庥玫鞍酌福褐Z維信；抗壞血酸、水楊酸、DPPH、鄰苯三酚等試劑：國藥試劑集團(tuán)；弱陰離子交換柱(DEAE FF)5 mL柱：GE公司；用于分子質(zhì)量測(cè)定的HPLC標(biāo)準(zhǔn)品由尿嘧啶(112 Da)、核糖核酸酶A(13.7 kDa)及牛血清蛋白(66 kDa)組成：蘇州賽分科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Eppendorf Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)，德國DASGIP公司；Triad 2.5 L冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；UltiMate 3000高效液相色譜，美國Dionex公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解工藝及蛋白酶篩選

考查不同種類蛋白酶對(duì)文蛤軟體酶解的效率。測(cè)定水解度與水解得率考察水解情況，選擇水解度高的蛋白酶研究復(fù)合酶解，確定最佳酶解工藝。

1.3.2 水解度與水解得率的測(cè)定

根據(jù)水解物中游離氮與總氮含量的比值計(jì)算酶解后的水解度。采用甲醛滴定法測(cè)定游離氮含量。取不同條件的酶解上清液5 mL于250 mL錐形瓶中，加入60 mL冷卻的去CO2水，攪拌并且精密測(cè)定其pH值。用0.1 mol/L的NaOH溶液(用基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定過)調(diào)節(jié)pH值至8.2，再加入pH值已中和至7.0的甲醛溶液20 mL，隨后記錄將其pH值滴定至9.2時(shí)所消耗的0.1 mol/L NaOH溶液的體積。利用凱氏定氮法測(cè)定樣品中總氮含量。水解得率反映酶解后可溶性物質(zhì)的得率，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

(1)總還原能力的測(cè)定

在不同梯度濃度的樣品中加入鐵氰化鉀，50 ℃加熱20 min后迅速冷卻，加入三氯乙酸，3 500 r/min離心10 min，取適量上清加入FeCl3，混勻靜置10 min，在700 nm處檢測(cè)吸光值。

(2)水楊酸法測(cè)定羥自由基清除能力

采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在 510 nm處測(cè)量含被測(cè)物反應(yīng)液的吸光度，并與空白液比較，以測(cè)定被測(cè)物對(duì)羥自由基的清除作用。在試管中加入一定濃度的待測(cè)液，依次加入FeSO4、水楊酸，蒸餾水補(bǔ)齊至10 mL，最后加入H2O2，靜置10 min后于510 nm處測(cè)定吸光值。

(3)DPPH·清除率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取7.0 mg的DPPH·，用無水乙醇定容至100 mL棕色容量瓶中于4 ℃避光保存。將制得的文蛤酶解物及各分離組分分別配制成不同濃度的溶液，分別取2 mL不同濃度的樣品溶液，和等體積已配制好的DPPH·溶液混合搖勻，常溫避光靜置30 min后于517 nm下測(cè)定其吸光度Ai，取2 mL DPPH·溶液與等體積無水乙醇混合，測(cè)定混合液的吸光度Aj，以及樣品溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度值A(chǔ)c，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)以Vc作為對(duì)照。DPPH·清除率按照公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧陰離子自由基清除率。取一定量的Tris-HCl緩沖液置于25 ℃水浴5 min，分別加入不同量的樣品溶液和鄰苯三酚，混勻后25 ℃繼續(xù)水浴5 min后加入HCl終止反應(yīng)，于420 nm 處檢測(cè)吸光值。

1.3.4 小分子酶解組分(enzymatic hydrolysate components with low molecular weight， LMEC)物質(zhì)分析

總蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定；灰分含量采用高溫灼燒法測(cè)定；脂肪含量采用索氏提取法測(cè)定；總糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定；水解氨基酸及游離氨基酸均采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 LMEC的分子質(zhì)量測(cè)定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)初步判斷分子質(zhì)量范圍，同時(shí)采用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)精確測(cè)定。

受經(jīng)濟(jì)下行、房地產(chǎn)調(diào)控等多重因素影響，2018年的廚電市場(chǎng)結(jié)束了持續(xù)長(zhǎng)達(dá)6年的高速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，不得已放緩了前進(jìn)的步伐。中怡康測(cè)算數(shù)據(jù)顯示，2018年1-9月，廚電市場(chǎng)零售額同比僅微增0.4%，消毒柜、電烤箱、吸油煙機(jī)、燃?xì)庠畹绕奉惥庥鰯嘌率较碌瑑H有洗碗機(jī)、水家電、熱水器、微波爐實(shí)現(xiàn)了正向增長(zhǎng)。其中，前三季度油煙機(jī)、燃?xì)庠罴跋竟窠K端零售量同比分別下滑14.82%、13.48%、22.11%。

SDS-PAGE條件：配制18%的分離膠，5%濃縮膠，樣品經(jīng)濃縮膠分離時(shí)，電壓為80 V，時(shí)間約為30 min；經(jīng)分離膠分離時(shí)，電壓為100 V，時(shí)間為100 min，電泳緩沖液為變性蛋白膠電泳緩沖液。電泳至藍(lán)色指示前沿至分離膠3/4位置時(shí)停止電泳。

HPLC條件：將LMEC用流動(dòng)相配成 1 g/L的溶液，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后進(jìn)行檢測(cè)。使用已知特定分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件為：色譜柱Zenix SEC-80，7.8×300 mm；流動(dòng)相為V(乙腈) ∶V(水)∶V(三氟乙酸)=40∶60∶0.05；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.6 LMEC的初步分離及肽序分析

采用DEAE-FF弱陰離子交換柱進(jìn)行初步分離，以NaCl溶液作為洗脫液。線性洗脫采用1 mol/L NaCl溶液，梯度洗脫設(shè)定NaCl溶液濃度在100 min內(nèi)由0增加至1 mol/L，之后在出峰濃度下進(jìn)行梯度洗脫，每次洗脫直到樣品基線平穩(wěn)至少5個(gè)柱體積再切換至下一濃度梯度。

對(duì)分離得到的組分進(jìn)行液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析(liquid chromatography and mass spectrometry, LC-MS)。液相色譜條件：色譜儀Waters Acquity UPLC；檢測(cè)器Waters Acquity PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)200～400 nm；流動(dòng)相為甲酸、乙腈溶液；柱溫45 ℃；流速0.3 mL/min； 進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：離子方式ESI+；毛細(xì)管電壓3.5 kV； 錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；質(zhì)量范圍20～2 000m/z。檢測(cè)數(shù)據(jù)使用MassLynx進(jìn)行氨基酸序列的推測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

以水解度及水解得率為判定指標(biāo)進(jìn)行水解用蛋白酶種類的選擇。由表1結(jié)果比較可知，風(fēng)味蛋白酶對(duì)文蛤軟體的水解度最高，為28.08%，其次為復(fù)合蛋白酶和酸性蛋白酶；中性蛋白酶酶解后可溶性組分的水解得率最高，為71.67%。基于以上結(jié)果，以風(fēng)味蛋白酶分別與復(fù)合蛋白酶及中性蛋白酶復(fù)配進(jìn)一步優(yōu)化酶解效果。風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶雙酶酶解后，水解度與水解得率分別為33.39%和76.27%，由此確定酶解用酶及條件。

表1 不同蛋白酶水解得率及水解度Table 1 Hydrolytic yield and hydrolytic degree of different protease

2.2 酶解工藝及得率

通過試驗(yàn)確定的最佳酶解工藝如圖1所示，將冷凍文蛤肉置于室溫下解凍1 h，煮沸10 min后按照1∶3(mg∶mL)的料液比加入去離子水勻漿。

圖1 文蛤軟體酶解工藝流程圖Fig.1 Flow chart of enzymatic hydrolysis of Meretrix Meretrix L.

勻漿后加入風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶各100 U/g濕重，在其最適酶解條件下酶解4 h。水解結(jié)束后于100 ℃ 滅活10 min，冷卻后4 ℃過夜，8 000 r/min離心去除沉淀，水解得率為76.3%，上清液經(jīng)3 kDa超濾分離得大分子組分(enzymatic hydrolysate components with high molecular weight, HMEC)、小分子組分(LMEC)，得率分別為60%和30%。

2.3 酶解物體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

總還原能力能客觀地反應(yīng)物質(zhì)的整體抗氧化活性[14]。其測(cè)定原理是鐵氰化鉀在抗氧化劑的作用下Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+進(jìn)一步和Fe3+反應(yīng)生成的普魯士藍(lán)在波長(zhǎng)700 nm處有吸收。吸收值越大，表示樣品的還原力越大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2所示，隨著各組分濃度的增大，其總還原能力也逐漸增大，當(dāng)質(zhì)量濃度高于20 g/L后，總還原力上升趨勢(shì)趨于平緩。酶解物(enzymatic hydrolysate components, EC)及小分子質(zhì)量組分(LMEC)的抗氧化活性差異不大，且略高于大分子組分(HMEC)。在質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，LMEC的總還原能力為54.16%。

圖2 酶解各組分的總還原能力Fig.2 Total reducing capacity of hydrolysate fractions

羥自由基是造成組織脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)解聚等的主要活性氧種類[15]。測(cè)定過程中，雙氧水在Fe2+的作用下生成羥自由基及Fe3+，向體系中加入水楊酸與羥自由基反應(yīng)，生成在510 nm處有特殊吸收的 2,3-二羥基苯甲酸。如果向反應(yīng)體系中加入具有清除羥自由基功能的物質(zhì)，有色化合物的生成量就會(huì)相應(yīng)減少。羥自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)。結(jié)果由圖3所示。

圖3 酶解各組分的羥自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of hydroxyl radical in various hydrolysate fractions

文蛤酶解各組分對(duì)羥自由基均具有一定的清除能力，酶解物整體組分略高于分離組分。隨著各組分質(zhì)量濃度的增大，羥自由基的清除率也緩慢升高，組分EC在23 g/L時(shí)羥基自由基清除率可達(dá)到53.5%。

DPPH·是一種較為穩(wěn)定的自由基。由圖4所示，文蛤酶解物各組分對(duì)DPPH·均具有一定的清除能力。組分EC與LMEC的DPPH·清除能力顯著高于HMEC，隨質(zhì)量濃度的升高，對(duì)DPPH·的清除率也逐漸增大，在15～20 g/L達(dá)到飽和，清除率最高約49%。

圖4 酶解各組分的DPPH自由基清除活性Fig.4 Scavenging activity of DPPH radical in various hydrolysate fractions

圖5 酶解各組分的超氧陰離子自由基清除活性Fig.5 Scavenging activity of superoxide anion radical in various hydrolysate fractions

文蛤軟體酶解物(EC)及其超濾分離的組分(LMEC、HMEC)均具有一定的抗氧化活性，其中，小分子組分的總還原能力與DPPH清除能力高于大分子組分。為進(jìn)一步探討LMEC產(chǎn)生抗氧化活性的原因，從組分的構(gòu)成角度首先進(jìn)行研究，分析LMEC的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.4 酶解產(chǎn)物L(fēng)MEC的組分構(gòu)成

各酶解組分的基本組成見表2。

表2 酶解產(chǎn)物的組成 單位：%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

由表2可看出，各組分中含量最高的物質(zhì)均為蛋白或肽類，所含質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到60%以上。超濾處理進(jìn)一步提高了LMEC的蛋白含量至79.01%，同時(shí)使得大部分脂肪與糖類物質(zhì)富集于HMEC組分中。文獻(xiàn)報(bào)道，小分子肽類具有良好的抗氧化活性，且更易被吸收[17]。NAZEER等[18]用木瓜蛋白酶酶解紫文蛤(Meretrixcasta)的產(chǎn)物具有很高的抗氧化活性，經(jīng)FPLC離子交換層析和凝膠過濾層析，分離得到具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)。張澤等[19]以水解度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了中性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解長(zhǎng)牡蠣的最佳工藝，并證明了酶解產(chǎn)物有一定的還原能力和對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。由此推測(cè)，LMEC的抗氧化活性與其含有大量的肽類物質(zhì)有直接關(guān)系。

2.5 LMEC中肽類組分分子質(zhì)量測(cè)定

首先采用SDS-PAGE重點(diǎn)對(duì)LMEC中的肽類組分進(jìn)行分析。由圖6可直觀看到，文蛤軟體經(jīng)雙酶酶解后(EC)，產(chǎn)生一系列大小不一的酶解產(chǎn)物，條帶分子質(zhì)量主要集中于16 kDa以下。通過超濾分離后，LMEC的分子質(zhì)量集中于1.2 kDa以下，僅由少量12～20 kDa組分殘留，說明超濾可較高效地將小分子肽類組分富集。

圖6 酶解產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)Fig.6 Detection of enzymatic hydrolysate fractions by SDS-PAGE

進(jìn)一步地，采用HPLC方法更精確地分析，結(jié)果如圖7-b所示。因組分較為復(fù)雜，LMEC的HPLC圖譜中在6.0～12.0 min形成較大的寬峰，12.0～16.0 min還有3個(gè)吸收峰。為判定其分子質(zhì)量，我們?cè)谕瑯拥囊合鄺l件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，結(jié)果如圖7-a所示。

a-標(biāo)準(zhǔn)品；b-LMEC圖7 LMEC及標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of LMEC and standard products

通過曲線擬合得到分子質(zhì)量與保留時(shí)間的線性計(jì)算式lgM=-0.544 7t+8.24，并以此計(jì)算得到LMEC的分子質(zhì)量為1.05 kDa，與SDS-PAGE的結(jié)果相吻合。

2.6 LMEC氨基酸組成分析

蛋白質(zhì)中氨基酸組成與其生理功能具有密切關(guān)聯(lián)[20]。LMEC的氨基酸組成如表3所示。LMEC含有較高含量的游離氨基酸，其中以三支鏈氨基酸(Leu、Val和Ile)和His含量較高。分析水解氨基酸組成可以看出，LMEC中肽類組分中主要含有Glu、Asp、三支鏈氨基酸及Arg等氨基酸單元。文獻(xiàn)報(bào)道，Arg及三支鏈氨基酸(branched chain amino acid, BCAA)是長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)參與供能的重要氨基酸[21]。由于肌肉中支鏈氨基酸分解非常活躍，BCAA能以相當(dāng)快的速率轉(zhuǎn)氨基和完全氧化，其氧化產(chǎn)生ATP的效率高于其他氨基酸，進(jìn)而可能影響機(jī)體的氧化指標(biāo)(如丙二醛、超氧化物歧化酶及乳酸脫氫酶等)[22-23]。

2.7 LMEC的初步分離與肽段組成分析

在測(cè)定LMEC氨基酸組成的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步了解LMEC可能含有的肽類構(gòu)成。為簡(jiǎn)化后續(xù)分析過程，首先對(duì)LMEC進(jìn)行初級(jí)分離。采用DEAE對(duì)LMEC進(jìn)行線性與梯度洗脫分離，結(jié)果如圖8所示。

表3 LMEC的氨基酸組成 單位：%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

a-線性洗脫；b-梯度洗脫圖8 DEAE線性及梯度洗脫曲線Fig.8 DEAE linear and gradient elution curves in DEAE

通過線性洗脫(圖8-a)，確定了樣品中成分在0、0.064、 0.163，0.37、1 mol/L NaCl濃度下可被洗脫，以此進(jìn)行NaCl梯度洗脫，如圖8-b得到4個(gè)組分，按照洗脫順序依次標(biāo)記為L(zhǎng)MEC1～LMEC4。

分別對(duì)獲得的4個(gè)洗脫組分進(jìn)行UPLC-MS聯(lián)用分析。分析4個(gè)組分的液相圖可知，LMEC1成分較為復(fù)雜，LMEC2、LMEC3及LMEC4譜圖類似。對(duì)4個(gè)組分中液相分析得到物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖9)，并基于質(zhì)譜系統(tǒng)的多肽分析方法進(jìn)行序列鑒定，得到其所含多肽的序列匯總?cè)绫?。

a-LMEC1;b-LMEC2;c-LMEC3;d-LMEC4圖9 LMEC的液相圖譜Fig.9 Liquid chromatogram of LMEC

表4 LMEC可能含有的多肽序列Table 4 Polypeptide sequences speculated in LMEC

分析發(fā)現(xiàn)，推測(cè)得到的多肽序列中多含有Ala、Thr、Val、Leu、Pro、Glu等，與LMEC的氨基酸組成分析結(jié)果相吻合。文獻(xiàn)報(bào)道抗氧化肽通常在N端含有疏水性氨基酸，如Val或Leu，且序列中多含有Pro、His、Tyr、Trp和Cys等氨基酸[24]。吳艷艷等[25]從珍珠貝的蛋白酶酶解產(chǎn)物中分離出相對(duì)分子質(zhì)量為1 039.56 Da的1種抗氧化肽，具有清除自由基的活性，其氨基酸序列為Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg。JIN等[26]通過酶解舟貝分離出Met-Cys-Leu-Asp-Ser-Cys-Leu-Leu(P1)和His-Pro-Leu-Asp-Ser-Leu-Cys-Leu(P2)2種抗氧化肽，均具有DPPH·及ABTS+清除活性。王雪琴等[27]也從鯖魚蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到Leu-Asp-Ile-Gln-Lys-Glu-Val(843.5 Da)和Thr-Ala-Ala-Ile-Val-Asn-Thr-Ala(759.4 Da)2個(gè)具有抗氧化活性的肽序。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)分析得到的肽段序列符合文獻(xiàn)中對(duì)于抗氧化肽的特征描述，因而與其具有的抗氧化活性存在一定的關(guān)聯(lián)。但其確定的抗氧化活性尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因而對(duì)LMEC的精細(xì)分離及活性驗(yàn)證工作還有待進(jìn)一步開展(圖10)。

3 結(jié)論

以水解度及水解得率為優(yōu)化依據(jù)，考察并篩選了文蛤軟體酶解用蛋白酶種類，確定了雙酶酶解的最佳條件為風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶各100 U/g，50 ℃水解4 h，優(yōu)化后的水解度是33.39%，水解得率是76.3%。 酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離得到LMEC及HMEC組分，通過體外抗氧化活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LMEC具有較好的抗氧化活性。進(jìn)一步對(duì)LMEC進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)分析發(fā)現(xiàn)，LMEC含有約79%的肽類物質(zhì)，分子質(zhì)量約1.05 kDa。通過離子交換初步分離并采用UPLC-MS聯(lián)用，分析并推測(cè)了LMEC中可能含有的6種肽序，富含Ala、Thr、Val、Leu、Pro、Glu等氨基酸單元，符合文獻(xiàn)報(bào)道的抗氧化肽序列特征。通過研究，從物質(zhì)層面對(duì)文蛤酶解物中產(chǎn)生抗氧化活性的肽類物質(zhì)進(jìn)行了初步定性分析，為文蛤抗氧化活性提供理論依據(jù)，也為后續(xù)活性肽的分離提供參考方向。

a～f-保留時(shí)間分別為11.05、11.71、11.80、13.04、16.69、18.84 min圖10 LMEC中可解析的肽類物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectra of LMEC